WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Оценка экспрессии ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции с помощью моноклональных антител

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АЛЕКСИНСКАЯ Марина Анатольевна

Оценка экспрессии

АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

НА ПОВЕРХНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА

в норме и при НАРУШЕНИЯХ репродуктивной функции

с помощью моноклональных антител

14.00.36 - аллергология и иммунология

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2006

Работа выполнена на Факультете Фундаментальной Медицины

Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

кандидат медицинских наук,

доктор биологических наук С.М. Данилов

кандидат биологических наук М.А. Николаева

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор М.А. Стенина

член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор В.С. Репин

Ведущая организация

Государственный Научный Центр “Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства”

Защита состоится «25» декабря 2006 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан « » ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В последнее время все больше внимания уделяется молекулярным механизмам репродукции и характеристике поверхностных структур сперматозоидов, определяющих способность клеток к оплодотворению. Изучение роли поверхностных белков важно для понимания механизмов фертилизации, причин бесплодия и для поиска адекватных способов коррекции нарушений репродуктивной функции.

Наиболее современным подходом к исследованию молекулярных механизмов взаимодействия клеток является использование моноклональных антител (МАТ). Получение МАТ к определенным антигенам (АГ) сперматозоидов позволяет изучать роль этих АГ в процессе оплодотворения. Исследуется возможность использования МАТ к АГ сперматозоидов при разработке новых способов иммуноконтрацепции (McCauley T.C. et al., 2002, Domagala A. et al., 2004).

Одним из белков, специфичных для сперматозоидов и привлекающих внимание исследователей, является тестикулярная изоформа ангиотензин-превращающего фермента, впервые описанная El-Dorry с соавторами (El-Dorry H.A. et al., 1982).

Ангиотензин-превращающий фермент (EC 3.4.15.1, CD143) – гликопротеин, расположенный на мембране клеток, выявляемый во многих тканях и жидкостях млекопитающих и имеющий широкий спектр действий. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) играет ключевую роль в ренин-ангиотензин-альдостероновой (РААС) и каликреин-кининовой системах, регулируя давление крови и гомеостаз электролитов (Hooper N.M., 1991, Corvol P. et al., 2004). АПФ – цинк-зависимая пептидил-дипептидаза, удаляющая C-концевой дипептид His-Leu, и осуществляющая превращение ангиотензина I в ангиотензин II (вазопрессор) и инактивацию брадикинина (вазодилятатор). АПФ может участвовать в метаболизме ряда других физиологически активных пептидов: вещества Р, энкефалинов, нейротензина, гонадотропин-релизинг гормона. Экспрессия АПФ была выявлена на поверхности эндотелиальных клеток легких, эпителиальных клеток кишечника, почек, нейроэпителиальных клеток мозга (Ryan J.W. et al., 1975, Danilov S.M. et al., 1987).

О важности РААС для процессов оплодотворения может свидетельствовать высокая концентрация АПФ в cеменной жидкости (СЖ), которая в 50 раз превышает концентрацию этого фермента в плазме крови (Depierre D. et al., 1978, Krassnigg F. et al., 1989). В 1982 году было описано наличие двух изоформ АПФ (El-Dorry H.A. et al., 1982), одна из которых, тестикулярная, расположена на поверхности сперматозоидов.

Было показано, что самцы мышей, у которых выключен (нокаутирован) ген АПФ, стерильны (Krege J.H. et al., 1995, Esther C.R. et al., 1997). В тоже время, при возобновлении экспрессии тестикулярной изоформы АПФ (тАПФ), но не соматической изоформы АПФ (сАПФ), фертильность у самцов мышей восстанавливается (Hagaman J.R. et al., 1998, Ramaraj P. et al., 1998, Kessler S.P. et al., 2000).

При попытках выявить связь между уровнем тАПФ и морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов были получены противоречивые результаты. В работе Kaneko с соавторами была отмечена позитивная корреляция между активностью АПФ и подвижностью сперматозоидов человека (Kaneko S. et al., 1984) и крупного рогатого скота. Однако, в более поздних работах выявлена негативная корреляция между активностью фермента и подвижностью сперматозоидов свиньи и человека (Siems W.E. et al., 1991, Khn F.-M. et al., 1998, Shibahara H. et al., 2001). В то же время, Khn с соавторами (Khn F.-M. et al., 1998) выявили отсутствие зависимости между уровнем активности АПФ и концентрацией/морфологией сперматозоидов. Использование фармакологических ингибиторов АПФ не оказывало влияния на подвижность сперматозоидов (Heder G. et al., 1994), но негативно отражалось на результатах взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки (Foresta C. et al., 1991, Khn F.-M. et al., 1998). Было показано, что тАПФ высвобождается с поверхности сперматозоидов во время капацитации и акросомальной реакции (Khn F.-M. et al., 1995, 1998), тогда как ингибирование АПФ предотвращает акросомальную реакцию и проникновение сперматозоидов в яйцеклетку (Foresta C. et al., 1991).



Несмотря на то, что исследования в этой области идут уже не один десяток лет, механизм влияния тАПФ на фертильность до сих пор не изучен. Анализ ферментативной активности и использование поликлональных АТ не позволяют выявлять тАПФ, а оценивают суммарную активность/экспрессию как тестикулярной АПФ, экспрессирующейся на поверхности сперматозоидов, так и соматической АПФ, сорбируемой клетками из семенной жидкости.

Таким образом, основной проблемой, связанной с определением роли тАПФ in vivo, является отсутствие адекватных методов количественной оценки экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов. Следовательно, получение МАТ к тАПФ и изучение роли АПФ в репродукции является актуальной задачей.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оценка экспрессии ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции, с помощью моноклональных антител.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

  1. Получить и охарактеризовать моноклональные антитела к тестикулярной изоформе ангиотензин-превращающего фермента.
  2. Разработать метод количественной оценки ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов с помощью моноклональных антител.
  3. Определить зависимость между экспрессией тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента и морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов.
  4. Количественно оценить экспрессию тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции.
  5. Определить возможность продукции антител к АПФ у мужчин с иммунным фактором бесплодия.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Впервые получены моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к нативной конформации тестикулярной изоформы АПФ человека.

Показано, что слущивание тАПФ с поверхности живых патологически измененных сперматозоидов в ходе экспериментальных манипуляций приводит к ложно-негативным результатам при выявлении АПФ на поверхности клеток.

Разработан способ количественной оценки тАПФ на поверхности сперматозоидов человека с помощью моноклональных антител 1Е10 с использованием метода проточной цитометрии.

Уровень тАПФ на поверхности сперматозоидов зависит от морфо-функциональных характеристик клеток. Максимальный уровень экспрессии тАПФ выявляется на поверхности морфологически измененных сперматозоидов и функционально-активных сперматозоидов с нормальной морфологией. Снижение функциональной активности морфологически-нормальных сперматозоидов – уменьшение скорости поступательного движения и увеличение вероятности спонтанной АР, сопровождается снижением экспрессии тАПФ на их поверхности.

Обнаружено что на поверхности морфологически нормальных сперматозоидов тАПФ локализуется в постакросомальной области головки, на шейке и средней части хвоста сперматозоидов. У сперматозоидов с патологически измененной морфологией головки тАПФ экспрессируется на всей поверхности головки клеток.

Аутоантитела к АПФ в семенной жидкости фертильных доноров и пациентов с бесплодием иммунного и неиммунного генеза не выявлены.

Показано, что уровень экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров выше, чем в группах пациентов с астенозооспермией и с бесплодием неясного генеза.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результаты исследования и основные рекомендации внедрены в программу лекций кафедры иммунологии ГОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Росздрава, и в практическую работу лаборатории клинической иммунологии ГУ НЦ Акушерства, Гинекологии и Перинатологии РАМН.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения и результаты исследования представлены и обсуждены на Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", "Ломоносов-2005" и "Ломоносов-2006" (Москва, 2004, 2005, 2006), Международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2004), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), VIII, IX и X Всероссийских научных форумах "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006), 15 и 16 Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, Германия, 2004, 2005), Республиканской научной конференции "Иммунология репродукции" (Иваново, 2005), 13 Международном студенческом конгрессе медицинских наук (Гронинген, Нидерланды, 2006), на апробационной комиссии МГУ им. М.В.Ломоносова 17 октября 2006 года. Диссертация обсуждена на межклинической конференции ГУ НЦ АГиП РАМН 30 октября 2006 года.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 15 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированного 35 рисунками, 5 таблицами. Указатель литературы включает в себя 153 источника отечественной и зарубежной литературы.





СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на базе Государственного Учреждения Научного Центра Акушерства, Гинекологии и Перинатологии РАМН (директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Кулаков В.И.) в лаборатории клинической иммунологии (зав. лабораторией академик РАМН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т.).

Получение и характеристика моноклональных антител к нативной и денатурированной формам тАПФ осуществлялось совместно с профессором Даниловым С.М. и Балясниковой И.В. (Исследовательский Центр Анестезиологии Университета Иллиноиса, Чикаго, США).

Компьютерный анализ подвижности сперматозоидов проводился сотрудником лаборатории клинической эмбриологии Левчук Т.Н. (зав. лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Кузьмичев Л.Н.).

Было проведено клинико-лабораторное обследование 10 фертильных доноров и 92 пациентов, состоящих в бесплодном браке.

Специальные методы исследования включали: выявление тАПФ методами проточной цитофлуорометрии (ПЦМ), флуоресцентной микроскопии и иммуноферментного анализа, характеристику движения сперматозоидов с помощью автоматического анализатора спермы, оценку акросомальной реакции сперматозоидов методом проточной цитофлуорометрии, определение уровня генерации свободных радикалов в эякуляте с помощью метода хемилюминесценции, выявление антиспермальных антител на поверхности сперматозоидов прямым тестом реакции смешанной агглютинации, выявление антител к АПФ в семенной жидкости методами иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинга.

Для оценки уровня экспрессии антигенов методом проточной цитометрии в каждом образце определяли: процент клеток, на поверхности которых выявлялись антитела к антигенам (ПЦМ%) и относительную интенсивность флуоресценции (ОИФ), отражающую количество антител на поверхности клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту и характеристика их специфичности

С помощью гибридомной технологии были получены МАТ (1B3, 1B8, 1E10, 1D8, 2B11, 2H9, 3F10, 3F11, 4E3), узнающие С-домен ангиотензин-превращающего фермента человека.

Сравнительный анализ полученных МАТ, был проведен методом клеточного ИФА. С помощью трансформированных клеток яичника китайского хомячка (cells hamster ovary – CHO), экспрессирующих тестикулярную (СНО-тАПФ) и соматическую (СНО-сАПФ) изоформы АПФ определяли специфичность МАТ и их концентрацию в растворе, необходимую для связывания с ферментом. На основе полученных данных была выбрана насыщающая концентрация белка равная 10 мкг/мл, а из всей панели МАТ, отобраны МАТ 1E10 и 4E3, как наиболее эффективно распознающие нативную конформацию тАПФ.

Оценку специфичности выбранных МАТ (1E10 и 4E3) проводили также с помощью метода проточной цитофлуорометрии (рис. 1)

 Количественная оценка связывания МАТ с поверхностью-0

Рисунок 1. Количественная оценка связывания МАТ с поверхностью трансформированных клеток яичника китайского хомячка, экспрессирующих соматическую (А) или тестикулярную (Б) изоформы АПФ методом ПЦМ. В качестве изотипического контроля использовались неимунные IgG мыши (гистограммы серого цвета).

МАТ i2H5+9B91 взаимодействовали практически со всеми СНО-сАПФ (рис. 1А) (ПЦМ% = 99,9%), как и МАТ 4E3 (ПЦМ% = 98,2%), при этом уровень связывания МАТ был очень высоким (ОИФ = 25,1 и 16,7, соответственно). В тоже время, уровень связывания МАТ 1Е10 с СНО-сАПФ (ОИФ = 1,9) был в 13 и 8 раз ниже, по сравнению с МАТ i2H5+9B9 и 4E3, соответственно. При использовании СНО-тАПФ (рис. 1Б) был выявлен высокий уровень связывания как МАТ 4Е3, так и МАТ 1Е10 с клетками (ПЦМ% = 99,7% и 98,2%, ОИФ = 24,6 и 23,9, соответственно). МАТ i2H5+9B9 с СНО-тАПФ практически не связывались (ПЦМ% = 0,6%, ОИФ = 0,9).

Методом клеточного ИФА были получены аналогичные результаты.

Специфичность связывания антител к сАПФ и тАПФ была подтверждена при анализе связывания МАТ с поверхностью нативных клеток человека - эндотелиальных клеток пупочной вены (экспрессирующих только сАПФ) и сперматозоидов (экспрессирующих только тАПФ) (рис. 2). В эксперименте была использована фракция активно-подвижных сперматозоидов, полученных методом флотации.

 Количественная оценка связывания МАТ к АПФ (серые гистограммы) с-1

Рисунок 2. Количественная оценка связывания МАТ к АПФ (серые гистограммы) с поверхностью сперматозоидов и эндотелиальных клеток пупочной вены человека методом проточной цитометрии. В качестве изотипического контроля использовались неимунные IgG мыши (неокрашенные гистограммы). МАТ анти-CD59 использовали в качестве положительного контроля.

МАТ 4E3, как и МАТ 1E10 взаимодействовали практически со всеми сперматозоидами (ПЦМ% = 93,1% и 93,4%, соответственно). В тоже время, связывание МАТ i2H5+9B9 со сперматозоидами практически не выявлялось (ПЦМ% = 6,1%). Уровень связывания МАТ 4Е3 и 1Е10 со сперматозоидами был практически одинаков (ОИФ = 16,1 и 17,0, соответственно), в то время как МАТ 1Е10 с эндотелиальными клетками связывались в 15 раз слабее, по сравнению с МАТ 4Е3 (ОИФ = 1,4 и 20,5, соответственно).

Таким образом, получены моноклональные антитела к нативной форме ангиотензин-превращающего фермента, которые могут быть использованы для оценки экспрессии тАПФ методом проточной цитофлуорометрии. МАТ 1E10 специфичны к тестикулярной АПФ, в то время как МАТ 4Е3 взаимодействуют как с тестикулярной, так и с соматической изоформами фермента.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.