WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АЛИЕВА Елена Васильевна

Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза

03.00.07 Микробиология

03.00.23 Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Тюменцева Ирина Степановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Ильин Вячеслав Константинович

доктор медицинских наук,

профессор Митрохин Сергей Дмитриевич

доктор биологических наук,

профессор Владимцева Ирина Владимировна

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессио-

нального образования Московская

медицинская академия им. И.М.Се-

ченова Росздрава

Защита состоится «____»________________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского»

Автореферат разослан «____»___________2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук С.Ю.Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Структура инфекционной патологии человека за последние десятилетия претерпела существенные изменения, обусловленные как открытием целого ряда неизвестных ранее инфекционных агентов (возбудители ВИЧ-инфекции; гепатитов В, С и Д; геморрагических и арбовирусных лихорадок; легионеллеза и т.д.), так и изменением роли и удельного веса хорошо известных возбудителей. Ко второй группе наряду с возбудителями туберкулеза, условно патогенными бактериями широкого спектра, вызывающими гнойно-септические заболевания и пневмонии, в полной мере можно отнести кампилобактерии и листерии (Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А., 2002; Покровский В.И. и др., 2004). Хотя упомянутые микроорганизмы давно известны, в последние годы заметно расширился удельный вес вызываемых ими инфекций, равно как и спектр их клинических проявлений.

Кампилобактериоз (вибриоз) – инфекционная болезнь животных и человека, вызываемая патогенными микроорганизмами рода Campylobacter, которые интенсивно циркулируют во внешней среде (вода, домашние и дикие животные). Анализ данных литературы показывает, что кампилобактериоз довольно широко распространен на всех континентах и во многих странах мира. Вследствие довольно широкого географического распространения, циркуляции среди животных и людей, у которых это заболевание протекает чаще всего как токсикоинфекция, кампилобактериоз приобретает существенное социально-экономическое значение.

Листериоз относится к числу природно-очаговых инфекций. Возбудителем листериоза является грамположительная аспорогенная бактерия Listeria monocytogenes. Листериоз у людей проявляется спорадически, но также описаны многочисленные вспышки пищевого листериоза и внутрибольничные заболевания в родильных домах. Заражение в основном происходит при употреблении в пищу инфицированных продуктов животного и растительного происхождения.

Внимание к листериозу возросло после расшифровки в конце 80-х годов прошлого столетия вспышек пищевого листериоза у людей с летальностью до 33 % в США, Канаде, Мексике, Швейцарии, Великобритании, то есть в странах с традиционно высоким уровнем здравоохранения и технологий приготовления продуктов питания.

Анализ состояния лабораторной диагностики как кампилобактериоза, так и листериоза позволяет предположить, что зарегистрированный уровень заболеваемости представляет лишь «вершину айсберга» и при совершенствовании организационных и методических вопросов лабораторной диагностики число зарегистрированных больных может значительно возрасти.

Ранняя лабораторная диагностика, т.е. своевременное выявление источника инфекции занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий. Современная микробиология характеризуется развитием диагностических технологий, основанных на глубоких фундаментальных знаниях биологии микроорганизмов и передовых инженерно-технических решениях задач автоматизации и повышения эффективности анализа (Онищенко Г.Г. с соавт., 2003). В связи с этим возникает необходимость в совершенствовании имеющихся иммунобиологических методов, создании новых экспресс-методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надежности и легкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.



Цель исследования: научная разработка экспресс-методов лабораторной диагностики возбудителей кампилобактериоза, листериоза и создание технологии производства медицинских иммунобиологических диагностических препаратов.

Основные задачи исследования:

1. Разработать транспортную, селективные и накопительные питательные среды для возбудителей кампилобактериоза и листериоза.

2. Подобрать эффективный метод извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных масс возбудителей кампилобактериоза и листериоза для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов.

3. Разработать производственные схемы получения иммунных сывороток с высокими титрами агглютининов и преципитинов и провести сравнительную оценку методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве иммунобиологических препаратов.

4. Определить оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных и иммунофлуоресцентных кампилобактериозных и листериозных иммуноглобулиновых конъюгатов.

5. Разработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами и на их основе создать тест-системы магноиммуносорбентные, а также методики их применения в экспресс-методах лабораторного анализа.

6. Определить параметры единого режима сублимации биополимеров (биологического сырья и МИБП) с целью сохранения их исходных свойств.

7. Оценить эффективность применения разработанных диагностикумов на экспериментальном, клиническом и полевом материале.

Научная новизна работы. Унифицирована питательная основа для транспортной, селективных, накопительных питательных сред, которые позволяют успешно выделять Campylobacter jejuni и Listeria monocytogenes от людей, животных, из пищевых продуктов, объектов внешней среды.

Подобраны эффективные методы, дающие возможность получения нативных специфических водорастворимых антигенных комплексов белковой природы из биомассы кампилобактерий и листерий.

Разработаны новые, высокоэффективные схемы иммунизации кроликов для получения специфических агглютинирующих и гипериммунных сывороток с высокими титрами.

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства кампилобактериозных и листериозных микрогранулированных органокремнеземных иммуносорбентов с магнитными свойствами, обладающих высокой сорбционной емкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.

Впервые сконструированы кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбентные тест-системы для иммуноферментного (ИФА) и количественного иммунофлуоресцентного (КИФА) анализов, позволяющие исследовать пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей традиционные.

Материалы выполненных исследований легли в основу двух патентов РФ на изобретение № 2135210 от 27.08.1999 г. «Способ получения диагностической сыворотки» ; № 2290641 от 27.12.2006 г. «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)».

Практическая значимость работы.

Разработаны накопительные питательные среды с соответствующими добавками для наращивания биомасс кампилобактерий и листерий.

Подобраны эффективные методы и приемы по извлечению антигенного материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов.

Оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркеров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза, индикации их возбудителей (эритроцитарные, иммуноферментные, иммунофлуоресцентные), стабильно отвечающие общим медико-биологическим требованиям (ОМБТ), предъявляемым к индикационным препаратам.

Разработан единый ускоренный экономичный режим стабилизации биологического сырья и МИБП методом сублимации, позволяющий сохранять их исходные свойства длительное время.

Таким образом, создан алгоритм технологического процесса получения диагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителей кампилобактериоза и листериоза, включающий в себя все этапы производства: от накопления биомассы на питательной среде до стабилизации полученных диагностических препаратов методом сублимационной сушки.

Внедрение результатов в практику.

Методики применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП изложены в «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике листериоза у людей»; «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике кампилобактериоза у людей»; «Методических рекомендациях «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях».

На диагностикумы листериозные эритроцитарные, флуоресцирующие, магноиммуносорбентные кампилобактериозные и листериозные для ИФА и КИФА составлена первичная нормативная документация (регламенты производства, фармакопейные статьи предприятия, инструкции по применению), прошедшая экспертизу в ОБТК СтавНИПЧИ, одобренная Ученым советом (протоколы №2 от 28.02.2002 г.; №6 от 26.06.2003 г.; № 2 от 28.02.2007 г.) и утвержденная директором института.





Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по повышению первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ, семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магноиммуносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Предложены научно-методические подходы к получению биологического сырья (антигенов и антител) для производства кампилобактериозных и листериозных МИБП, которые дают возможность повысить их качество.
  2. Разработаны методические приемы конструирования эритроцитарных, иммуноферментных, иммунофлуоресцентных диагностикумов, обеспечивающие высокую эффективность обнаружения антигенов кампилобактерий и листерий и антител к ним.
  3. Создана биотехнология изготовления кампилобактериозных и листериозных твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных органоминеральных магноиммуносорбентов; тест-системы магноиммуносорбентные для экспрессных методов иммуноанализа (ИФА, КИФА) позволяют максимально концентрировать патоген в исследуемом материале, что дает возможность повысить разрешающуюся способность экспересс-методов.
  4. Результаты практического применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП, демонстрирующие повышение эффективности лабораторных исследований клинического и полевого материала.

Апробация работы. Диссертация обсуждена и одобрена на заседании Ученого совета ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора, протокол № 3 от 15 мая 2007 года. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научной конференции «Проблемы биологии и химии на Северном Кавказе», посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ (Ставрополь, 2001); научной конференции Ставропольской медицинской академии (Ставрополь, 2002); международной научно-практической конференции «Биоресурсы, биотехнологии, инновации Юга России», 21-24 октября 2003 г. (Ставрополь-Пятигорск); научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей (Ставрополь, 2005);

II съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации на базе Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 15-17 ноября 2006 г. (Санкт-Петербург).

Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 3 НИР, отражено в 37 научных публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, приложений.

Она изложена на 245 страницах, содержит 24 таблицы и 28 рисунков. Список литературы включает 295 отечественных и 196 зарубежных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использованы 33 штамма микроорганизмов II, III, IV групп патогенности родов: Campylobacter, Listeria, Yersinia, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus, Escherichia.

Использованы 35 кроликов породы «Шиншилла». При выполнении работы обследовано 800 человек (от них 920 проб), исследованы 931 проба от животных и птиц, 1005 проб из объектов внешней среды, в том числе 275 – пищевых продуктов, 280 – воды, 200 - почвы, 20 – сточных вод птицефабрик, 50 смывов с технологического оборудования и 20 проб промывных вод сырного производства.

Антигены микроорганизмов изолировали водно-солевой экстракцией с последующей ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток. Дезинтегрирование осуществляли на аппарате УЗДН -2Т (Россия).

Иммунизацию животных проводили с применением иммунокорректоров тималина, циклофосфана и тимогена. Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлуоресценции по T.H.Weller, A.H.Coons (1954). Для осаждения белков использовали сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980); метод фракционирования белковых смесей с использованием высокомолекулярного, незаряженного, линейного полимера – полиэтиленгликоля - 6000 (ПЭГ) по A.Polson и др. (1964). Иммуноглобулины также преципитировали каприловой (октановой) кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969).

Количественное определение белка проводили по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Специфическую активность антигенов микроорганизмов и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по O. Ouchterlony (1949).

Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1974), с флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ) фирмы «Sigma» проводили по X.Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по A.H.Coons, M.H. Kaplan (1950). Очистку конъюгатов от непрореагировавшего флуорохрома осуществляли методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985).

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К.Nakane, А.Kawaоi (1974) в модификации Е.А.Ткаченко с соавт. (1982). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M.Clark и A.Adams (1977) в “сэндвич”- варианте ИФА. Очистку конъюгатов от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.