WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |

Реактивность и пластичность тканевых компонентов печени в сравнительном ряду позвоночных в норме и после гипертермии

-- [ Страница 2 ] --

4. В сравнительном ряду выявлены видоспецифичные отличия активности изучаемых оксидоредуктаз митохондрий и цитозоля, биохимических маркеров гибели гепатоцитов, содержания ионов [Са2+]i, [К+]i и [Nа+]i. Гипертермия определяет дифференцированную модификацию активности оксидоредуктаз, содержания ионов, соответственно реализацию в большей мере программы гибели гепатоцитов по пути некроз/аутофагия и реализацию реакций как гипо-, так гиперкатаболизма.

5. В клеточных культурах гепатоцитов, в сравнении с in vivo, установлены видовые различия в индексе пролиферации, направлениях гибели и показателях энергетического и пластического обмена гепатоцитов. Гипертермия приводит к ультраструктурным изменениям гепатоцитов, смене путей клеточной гибели, разнонаправленному изменению активности оксидоредуктаз, биохимических маркеров клеточной гибели, отражая развитие реакции как гипо-, так и гиперкатаболизма гепатоцитов.

Апробация результатов научных исследований

Результаты исследований обсуждены на Международной конференции орнитологов «Актуальные проблемы изучения и охраны птиц Восточной Европы и Северной Азии», Казань, 2001; Международной научно-практической конференции «VI Царскосельские чтения», С-Петербург, 2002; VI конгрессе международной Ассоциации морфологов, г. Уфа, 2002; Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики XXI века» и Международном симпозиуме «Пиридоксальфосфат – зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина», Москва, 2002; Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», С-Петербург, 2003; Всероссийской научной гистологической конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях», посвященной памяти Ф.М. Лазаренко, Оренбург, 2003; III Региональной научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды, Челябинск, 2004; V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов с международным участием, г. Казань, 2004; VII Международном конгрессе ассоциации морфологов, Москва, 2004; XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004; VII Всероссийской конференции по патологии клетки, Москва, 2004; Международном научном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2004; Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере», Сургут, 2004; II Международном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио-2006» Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2006; Научном совещании гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях», С.-Петербург, 2006; V Научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Таиланд (Паттайа), 2008; Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященной памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко, Оренбург 2008; Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» посвященной П.В. Дунаеву, Тюмень, 2008; IX Международной ассоциации морфологов и IV съезде ассоциации морфологов Узбекистана, Бухара, 2008.

Публикации. Основные положения диссертации представлены в 32 печатных работах. В изданиях, рекомендованных ВАК, - 11. Одно учебное пособие.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 397 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: обзор литературы, изложение материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждение полученных данных, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 187 фотографиями и схематичными рисунками, 18 таблицами. Список использованной литературы включает 768 работ, в том числе зарубежных 578 зарубежных авторов.

Выражаем благодарность профессору, д.м.н. член. кор. АНТ Киясову А.П., ст.н.с., доценту Вакулину Г.М., к.м.н. доценту Гумеровой А.А., к.б.н. Калашниковой М.М., д.в.н., профессору Плешаковой В.И., д.б.н., профессору Рябчиковой Е.И., д.м.н. Спиридонову В.К., д.м.н., профессору Семченко В.В., к.м.н Хижняк А.С, д.м.н., профессору Шурлыгиной А.В. за помощь, оказанную на всех этапах проведения исследования.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для решения поставленных задач по выявлению и оценки деструктивных и восстановительных процессов использованы две экспериментальные модели: in vivo и in vitro, которые включали 5 групп позвоночных животных:

1. Рыбы - вид Carassius auratus gibilio Bloch, 1782, карась серебряный (двухлетки – 2+).

2. Амфибии - вид Rana terrestris Andrzejewski, 1832 (Rana arvalis Nilsson, 1842), остромордые лягушки самцы (трехлетки).

3. Пресмыкающиеся (рептилии) - вид Pscudemia (Chrysemys scripta var. Elegans 1889, Trachemys scripta elegans) красноухие половозрелые черепахи самцы (пять лет развития).

4. Птицы - вид Columba livia (forma domestica) Gmelin, 1789, половозрелые сизые голуби самцы (6 месяцев развития).

5. Млекопитающие - вид Rattus norvegicus (var. alba) Berkcnhout, 1769, половозрелые беспородные крысы самцы (2 месяца постнатального развития).

Эксперимент перегревания поставлен на 180 животных (из них 75 служили контролем). Острого перегревания в системе in vivo эндотермных животных достигали путем пребывания животных в течение 30 минут в воздуховентилируемой камере «Chirana» при температуре 42°С. Для группы эктотермных животных перегревание проводили, в зависимости от видовых границ температурного оптимума, в водной среде при температуре 32°С для рыб и амфибий и 42°С для рептилий, в условиях свободного плавания с дополнительной аэрацией в течение 30 минут. Температурное воздействие в заданном режиме приводило к развитию теплового удара средней тяжести (G. N. Somero, 2002; A. E. McKechnie, 2004; Y.-M. Chang, 2005). Исследование модели in vitro проводилось на 30 животных, анализировалось 750 закладок клеточных культур гепатоцитов. Перегревание гепатоцитов в системе in vitro осуществляли на вторые сутки культивирования на водяной бане в течение 30 минут при температуре для культур гепатоцитов млекопитающих, птиц и рептилий 42°С, а для культур рыб и амфибий 32°С.



Методы исследования

Световая микроскопия. Образцы печени фиксировали в жидкости Карнуа, 10% - нейтральном забуференном формалине (М. А. Валовая, и др., 1993), заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по методу Ван-Гизон. На гистологических срезах определяли диаметр сосудов ацинуса (артериолы, венулы, желчного протока, лимфатического сосуда, синусоидов, центральной вены). Морфометрические показатели объема ядер (мкм3) и цитоплазмы (мкм3) гепатоцитов определяли в 3-х зонах ацинуса с помощью окуляр-микрометра МОВ-I-15х (объектив х40, 90), тест - сетки на 1мм2 и 0,04 мм2 (Г. Г. Автандилов, 2002). Количество живых и погибших гепатоцитов определяли в гомогенатах, окрашенных трипановым синим (107кл/мл) в камере Горяева (A. Lang, 2000).

Иммунофенотипирование клеток печени. Стромально-паренхимное соотношение клеточных типов печени, пролиферативную активность и полиплоидизацию гепатоцитов определяли с помощью выявления антител к белкам-маркерам этих клеток (М. В. Угрюмов, 1991; А. П. Киясов, 1998, 2000). Интенсивность и топографию процессов пролиферации и полиплоидизации по зонам печеночного ацинуса определяли путем подсчета на 1000 гепатоцитов количества двуядерных форм и PCNA-позитивных гепатоцитов. Парафиновые срезы окрашивали антителами к PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen; Ig – мышиные МАТ; клон РС 10; разведение 1:100; DAKO) гепатоцитов стрептавидин-биотиновым методом. Клетки Ито окрашивали антителами к десмину (Ig – МАТ; клон – десмин D 33; разведение 1:30; DAKO, DENMARK) так же стрептавидин-биотиновым методом. Антигены выявлялись после предварительной демаскировки методом HIAR (Нeat-Induced Antigen Retrieval) (S. H. Shi, et.al., 1991; R. Von Wasielewski, et.al., 1994). После инкубации с первичными антителами далее инкубировали биотинилированными вторыми антителами (Link, DAKO LSAB+Kit Peroxidase), со стрептавидином, коньюгированным с пероксидазой хрена (Streptavidin, DAKO LSAB+Kit Peroxidase). В качестве субстрата пероксидазной реакции использовали раствор аминоэтилкарбазола (АЭК) и перекиси водорода. Гистохимическая реакция определения активности эндогенной пероксидазы на парафиновых срезах проводилась с целью выявления клеток Купфера по методу МакФи (R. Moll, 1990, Д. Н. Маянский, и др., 1992, J. L. McPhie, 1979). Подсчет числа типов и пролиферирующих гепатоцитов проводился на площади в 0,04 мм2.

Цитофотометрия ДНК гепатоцитов. Методом оптико-структурного анализа (ОСА) ДНК определяли долю гепатоцитов по фазам клеточного цикла - G0, S, G2+M, гиподиплоидные. Мазки печени окрашивали по Фельгену в модификации G. Olson, в реактиве Шиффа. На препаратах определяли состояние обеих фракций хроматина: интегральную плотность, общую интегральную плотность, площадь распределения, площадь ядра, оптическую плотность, среднюю оптическую плотность, периметр, коэффициент округлости хроматина. В каждой группе у каждого животного количество ДНК было измерено в 200 ядрах (одноядерные) (Г. И. Козинец, 2002). Фотографирование и обработка препаратов проводилась на автоматизированном морфометрическом комплексе «Axioplan" («Karl Zeiss», Германия).

Флуоресцентная микроскопия. Тест «живое и мертвое» (life and dead assay) (Liu et al., 2000, Лямзаев 2007) проводили путем прижизненного окрашивания гепатоцитов ядерными красителями Hoechst 33342 (Sigma, США; р-р в концентрации 20 мкг/мл на среде МЗ в течение 15 мин) (A. Lang, 1995; J. N. Harada, 2005) и йодистым пропидием (Sigma, США; р-р в концентрации 20 мкг/мл на среде МЗ в течение 25 мин), для разделения гепатоцитов на группы, основываясь на критериях - состояние плазматической мембраны и ядра с целью выявления апоптоз/некрозного соотношения гепатоцитов (Е. О. Данченко, 1999; А. А. Чиркин, 1999; T. Patel, 1995, К. Г. Лямзаев, 2007). Использовался флуоресцентный микроскоп «Axioscope» («Karl Zeiss», Германия) с применением блока фильтров «Голубая» при длине волны 500-550 и 600-700. Проводился подсчет фрагментированных ядер в расчете на 300 клеток.

Культивирование гепатоцитов in vitro. Гепатоциты выделяли методом двойной перфузии печени раствором коллагеназы (P. Rijnties, 1986). Выделение гепатоцитов проводили согласно запатентованным модификациям этапов выделения гепатоцитов (Рег. № 2008132219 от 08.08.2008). Гепатоциты культивировали на покровных стеклах, предварительно обработанных 0,2% раствором желатина в чашках Петри (Sigma, США). Инкубировали в среде F12, которая содержала 0,2мг/мл альбумина (Sigma, США) и 0,5мкг/мл инсулина (Sigma, США), а также 40 мкг/мл гентамицина, 10% фетальной сыворотки (PAA, Австрия), 25 ед/мл фактора LIF (Sigma, США). Воздушная среда – 5% СО2 и 95% воздуха. Культивирование проводили при температуре 37/20С. Подсчет клеток проводили с помощью теста на исключение красителя (A. Lang, 2000; H. Wendler, 2005). В эксперименте использовались суспензии с количеством жизнеспособных гепатоцитов <96% (H. Ikeda, et. al., 2003; P. L. Else, 2004, M. Busk, 2005; T. Joseph, 2006). Для морфометрических исследований через двое суток культивирования покровные стекла фиксировали в абсолютном ацетоне и хранили при 20°C. Индекс пролиферации (ИП) культур определяли отношением А/Б, где А- численность клеток в культуре после окончания времени инкубации; Б – исходная численность клеток в момент посева культур. С помощью МТТ-теста - (Sigma, США) выявляли потенциальную жизнеспособность клеточных культур определяли по величине оптической плотности формазана на фотометре («MultiScan MCC340, Labsystems») при длине волны 570нм (М. Ю. Еропкин, 2000).





Электронная микроскопия. Электронномикроскопическое исследование проводилось для оценки объемной плотности (мкм/мкм/%), поверхностной плотности (мкм2 /мкм3) и численной плотности (мкм0/мкм3) митохондрий, хроматина, ГЭС, АЭС, ядрышка, липидов, лизосом, гликогена гепатоцитов. Анализировали 50 полей зрения паренхимы печени, произвольно отснятых при просмотре материала в электронном микроскопе при увеличении 3000–20000. Объемную, поверхностную и численную плотность изучаемых структур проводили на электроннограммах с использованием встроенной программы «UTHSCSA ImageTool 3.0». Количественные параметры оценивали на единицу площади (100мкм2) паренхимы печени. Образцы печени животных фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5%). После фиксации материал заключали в парафин, готовили срезы толщиной 10мкм, окрашивали 0,1% толуидиновым синим. Далее образцы печени дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе «Hitachi-600H» (Япония).

Биохимические методы. Монослой культуры гепатоцитов in vitro предварительно обрабатывали 0,1% раствором тритона Х-100, снимали со стекла раствором версена 0,2 г/л раствора Хенкса по методике Р.Адамса (1983). Митоходриальную и цитозольную фракции в обеих моделях получали методом дифференциального центрифугирования. Активность оксидоредуктаз: ИДГ-НАД (КФ 1.1.1.41), ИДГ-НАДФ (КФ 1.1.1.42), МДГ-НАД (КФ 1.1.1.37), МДГ-НАДФ (КФ 1.1.1.40), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) (КФ 1.1.1.49), а так же ЛДГ (КФ 1.1.1.27) определяли на СФ-26 при =340 нм, регистрируя оптическую плотность при изменении концентрации восстановленных форм НАД/НАДФ в нмоль субстрата/мин на мг белка (М. И. Прохорова, 1982; А. Е. Медведев, 1994; A. C. Gibb, 2002; A. M. Neyrinck, 2005). Активность каспазы-3 (CPP-32) проводили с помощью коммерческого набора «Caspase-3 Assay Kit» «Sigma» на спектрофотометре «Platr Reader Star-30 KENSTAR» в мкм/мг белка. Свободную активность кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) определяли спектрофотометрически в цитозольной фракции по скорости гидролиза n-нитрофенилфосфата/г/мин (Merck, Германия) (R. Maciejewski, 2001). Содержание ионов определяли ионоселективным методом в цитозольной фракции с помощью прибора «EasyLyte Calcium» в 100 мкл субстрата, выражали в миллиэквивалент/литр и в ммоль/л. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури (С. Н. Лызлова, и др., 1997).

Статистическая обработка полученного материала осуществлена с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA-5» (О. Ю. Реброва, 2002). За критический уровень значимости принимали р=0,05. Определяли статистические характеристики изучаемых параметров: средняя квадратическая, медиана, дисперсия. Выявляли критерий согласия 2 Пирсона, равенство дисперсий (Фишера-Снедекора) согласно которым определяли возможность применения параметрических и непараметрических методов анализа характера различий между независимыми выборками (критерий Манн-Уитни, Стьюдента, однородности Вилкоксона-U, Лапласа-Z, 2 Пирсона). Для выявления степени сопряженности исследуемых показателей, межвидовых различий применялся корреляционный анализ Пирсона (r), Mann-Whitney тест, многофакторный дисперсный анализ MANOVА.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

  1. Реактивность и пластичность печени на органном уровне

Печень рыб, амфибий, рептилий и птиц представляет собой железу трубчатого строения. Однако у птиц отмечается формирование коротких трабекул из гепатоцитов в два ряда, подобно млекопитающим. Пигментные клетки выявлены у всех изучаемых животных, за исключением млекопитающих. По всей видимости, у млекопитающих система детоксикации гепатоцитов более совершенна и не требует дополнительного участия пигментных клеток и меланомакрофагальных центров, как это выявлено у других групп животных. Соединительнотканная строма печени лучше (окраска Ван-Гизон) развита у млекопитающих. За счет слабо развитой стромы органа опорную функцию у рыб, амфибий и рептилий выполняют межклеточные контакты и коллагеновые волокна в пространстве Диссе.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.