WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе fxyd5cox7a1 хромосомы 19 человека

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Дидыч Дмитрий Александрович

Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека

специальность 03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Акопов Сергей Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович

кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

Защита состоится 2010 года в часов на заседании диссертационного совета Д002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор физ.-мат. наук В.А. Олейников

Общая Характеристика работы

Актуальность проблемы.

Вся совокупность генов и транскрибируемых областей генома многоклеточных организмов связана в сложнейшую регулируемую сеть, определяющую существование многочисленных типов специализированных клеток. Первостепенную роль в существовании этой регулируемой сети играют различные классы цис-регуляторных элементов генома. После определения полной нуклеотидной последовательности геномов ряда организмов одной из главных задач современной геномики стало изучение функциональных некодирующих элементов генома, таких как промоторы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, S/MAR-элементы и др.

Известно, что функциональная активность регуляторного элемента генома зависит не только от его нуклеотидной последовательности, но и от специфического набора связывающихся с ними белковых факторов транскрипции, модификации ДНК этого элемента, положения данной последовательности на хромосоме, структурной компартментализации ядра и др. По этим причинам, несмотря на стремительное развитие методов биоинформатики, использование компьютерных подходов для предсказания положения в геноме цис-регуляторных элементов крайне затруднительно.

Согласно теоретическим предсказаниям в геномах эукариотических организмов содержатся сотни тысяч цис-регуляторных последовательностей (Pennisi, 2004). Поэтому создание подходов, позволяющих осуществить как масштабный поиск этих элементов в геноме, так и их функциональный анализ, является одним из приоритетных направлений современной функциональной геномики.

В последнее время было предложено большое число различных экспериментальных подходов для идентификации регуляторных последовательностей внутри генома. Во всех этих подходах используется один и тот же ключевой этап получение высокообогащенных клонотек фрагментов ДНК, содержащих соответствующие регуляторные элементы. После конструирования таких клонотек нахождение их места в геноме становится чисто технической задачей и может быть осуществлено при помощи различных технологий, таких как гибридизация с геномными микрочипами, массированное секвенирование, технологии, сходные с SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) и др. Эти подходы можно разделить на две группы. В первую входят методы, которые можно назвать структурными, т.е. методы, основанные на взаимодействии ДНК с белками или субклеточными структурами, а также на структурных особенностях ДНК. В данной работе были задействованы функциональные подходы, относящиеся ко второй группе методов, обычно использующих “метод репортерного гена”.

К сожалению, на сегодняшний день картирование всех функциональных областей на уровне целого генома с учетом всевозможных типов клеток многоклеточных организмов выходит за пределы наших возможностей. Поэтому, альтернативой данного рода исследованиям служит полный функциональный анализ отдельных протяженных сегментов генома с последующей интеграцией полученных данных и созданием полной геномной карты регуляторных элементов.

В нашей лаборатории проводится работа по построению полной функциональной карты регуляторных последовательностей, расположенных в полигенном сегменте длиной 1 млн. п.о. хромосомы 19 человека. Ранее в этом локусе нами были идентифицированы и нанесены на карту около сотни последовательностей, относящихся к различным классам функциональных элементов генома, что делает исследуемый нами локус одним из наиболее охарактеризованных участков генома человека.

Данная диссертационная работа состоит из трех частей. В первой части описан подход, позволяющий проводить скрининг геномных фрагментов по их способности усиливать экспрессию репортерного гена (потенциальные энхансеры) и определять их местоположение в геноме. С помощью этого метода нами были обнаружены и картированы 15 потенциальных энхансеров в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека. Во второй части работы с помощью ранее разработанной методики (Akopov et al., 2006) произведено картирование в том же локусе десяти новых последовательностей, проявляющих инсуляторную активность. Третья часть посвящена анализу энхансер-блокирующей активности десяти обнаруженных ранее в исследуемом локусе CTCF-связывающих последовательностей (Vetchinova et al., 2006). Было показано, что все десять проверенных CTCF-связывающих последовательностей проявляют энхансер-блокирующую активность в системе позитивно-негативной селекции.



Цели и задачи работы.

Целью диссертационной работы являлось выявление и картирование цис-регуляторных элементов (энхансеры, инсуляторы) в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека, а также выявление энхансер-блокирующей функции десяти ранее обнаруженных в исследуемом локусе CTCF-связывающих фрагментов (Vetchinova et al., 2006) с помощью позитивно-негативной селекции.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. С помощью предложенного нами подхода выявить и картировать в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека последовательности, проявляющие свойства энхансеров.

2. Провести анализ обнаруженных фрагментов методом сдвига электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (EMSA), а также определить активность обнаруженных фрагментов с помощью системы двойной люциферазной детекции.

3. Выявить с помощью ранее разработанной в лаборатории системы позитивно-негативной селекции энхансер-блокирующих элементов все, или почти все, потенциальные инсуляторы, расположенные в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека.

4. Проверить на наличие энхансер-блокирующей активности десять ранее выявленных CTCF-связывающих последовательностей, расположенных в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе разработан оригинальный метод функционального картирования энхансер-подобных элементов в протяженных участках генома, основанный на отборе геномных фрагментов по их способности усиливать транскрипцию репортерного гена. С помощью предложенного подхода впервые идентифицированы в клетках культуры HeLa 15 потенциальных энхансеров в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека. Было показано, что идентифицированные последовательности взаимодействуют in vitro с белками ядерного экстракта HeLa. Для 13 обнаруженных последовательностей была показана способность активировать сильный промотор SV40 при транзиентной трансфекции клеток HeLa с использованием системы двойной люциферазной детекции. Была построена карта распределения обнаруженных в работе потенциальных энхансеров в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека.

С помощью ранее разработанной методики идентификации потенциальных инсуляторов (Akopov et al., 2006) выявлены и картированы 10 новых последовательностей в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека. Был проведен исчерпывающий анализ полученной в работе библиотеки потенциальных инсуляторов, позволивший обнаружить в исследуемом локусе большую часть последовательностей, проявляющих свойства инсуляторов.

В работе с помощью системы позитивно-негативной селекции был проведен анализ энхансер-блокирующей активности десяти CTCF-связывающих последовательностей, картированных ранее в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека.

Данная диссертационная работа является частью масштабной работы, направленной на создание полной функциональной карты области хромосомы 19 человека длиной 1 млн. п.о.

Публикации и апробация работы.

По теме диссертационной работы опубликованы 3 статьи в отечественных и зарубежных научных журналах. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов–2008” (Москва, 2008); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 3rd ESF Functional Genomics Conference “Functional genomics and Disease” (Инсбрук, 2008); XXI Зимняя международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009).

Структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на … страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего … ссылки. Диссертация содержит … таблиц и … рисунков.

РЕзультаты и их обсуждение

Идентификация и картирование энхансер-подобных элементов в локусе FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека.

Энхансеры – тип регуляторных элементов генома, способных усиливать транскрипцию с промоторов, находясь на значительных расстояниях от них. Для многих энхансеров показана их способность активировать гетерологичные промоторы. Основываясь на этих свойствах энхансеров, нами предложен метод, позволяющий идентифицировать энхансеры в протяженных участках генома по способности этих элементов активировать транскрипцию гена неомицинфосфотрансферазы II (NPTII), находящегося под контролем минимального промотора цитомегаловируса (CMV). Схема метода изображена на рис. 1-Б.Энхансеры – тип регуляторных элементов генома, способных усиливать транскрипцию с промоторов, находясь на значительных расстояниях от них. Для многих энхансеров показана их способность активировать гетерологичные промоторы. Основываясь на этих свойствах энхансеров, нами предложен метод, позволяющий идентифицировать энхансеры в протяженных участках генома по способности этих элементов активировать транскрипцию гена неомицинфосфотрансферазы II (NPTII), находящегося под контролем минимального промотора цитомегаловируса (CMV). Схема метода изображена на рис. 1-Б (стр. 5).





На первом этапе работы нами был получен вектор pQCXIX-Enh, предназначенный для отбора геномных фрагментов, обладающих энхансерной активностью (Рис. 1-А). Вектор был сконструирован на основе самоинактивирующегося ретровирусного вектора pQCXIX (Clontech), и содержал ген составного белка GTN, в состав которого входила неомицинфосфотрансфераза II. Были получены контрольные векторные конструкции: положительный pQCXIX-Enh(+), содержащий ген GTN под контролем минимального промотора и энхансера CMV, и отрицательный pQCXIX-Enh(-), из которого был удален минимальный промотор CMV.

Подготовка и клонирование библиотеки геномных фрагментов в ретровирусный вектор pQCXIX-Enh.

Отбор фрагментов, обладающих энхансерными свойствами, проводили из фрагментов геномной библиотеки локуса FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека, любезно предоставленной И.П. Черновым. При конструировании библиотеки 30 космид, содержащих перекрывающиеся фрагменты исследуемого локуса длиной 1 млн. п.о., были обработаны ферментами рестрикции Sau3A и Csp6I, позволяющими получить фрагменты длиной от 200 до 700 п.о. Два фермента было использовано для того, чтобы исключить потери функциональных элементов из-за присутствия сайта расщепления внутри функциональной области фрагмента. К выступающим концам рестриктных фрагментов посредством специфических олигонуклеотидных адапторов был присоединен праймер LP, содержащий сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции SalI. Итоговая библиотека содержала около 4 тыс. уникальных фрагментов.

Фрагменты библиотеки клонировали по сайту XhoI в вектор pQCXIX-Enh. Было получено около 16 тыс. колоний E. coli, из которых была выделена плазмидная ДНК и получен пул плазмид pQCXIX-Enh(L), представляющий собой набор ретровирусных векторов pQCXIX-Enh(L), содержащих фрагменты библиотеки локуса FXYD5COX7A1 хромосомы 19 человека.

Отбор последовательностей ДНК, обладающих энхансерной активностью.

Набором плазмид pQCXIX-Enh(L), а также контрольными конструкциями, проводили трансфекцию клеток пакующей линии Phoenix-AMPHO (Kinsella and Nolan, 1996). Клетки линии Phoenix-AMPHO способны экспрессировать вирусные белки, необходимые для образования амфотропных вирусных частиц.

Были получены четыре популяции вирусных частиц: pQCXIX-Enh, pQCXIX-Enh(L), pQCXIX-Enh(+) и pQCXIX-Enh(-). Определение титра вирусных частиц проводили по экспресс-методу, предложенному в работе Byun et al. (Byun et al., 1996). Для каждой популяции титр составил не менее 5•103 частиц/мл.

Полученными вирусными частицами инфицировали клетки линии HeLa. Выбор клеточной культуры был обусловлен тем, что ранее в нашей лаборатории были картированы в исследуемом локусе S/MAR-элементы (Chernov et al., 2002),а также участки связывания белка CTCF (Vetchinova et al., 2006) с использованием этой клеточной линии. Инфицированные клетки HeLa культивировали в среде с генетицином (800 мкг/мл) в течение двух недель.

В результате инфекции происходит интеграция кДНК-копии вирусной мРНК в геном хозяйской клетки. Если интегрированная кассета содержит фрагмент библиотеки, усиливающий активность гена селективного маркера (NPTII в составе белка GTN), т.е. проявляющий энхансерную активность, то содержащие такую конструкцию клетки выживают в среде с генетицином. После селекции клеток из них была выделена геномная ДНК и проанализирована с помощью двустадийной ПЦР (nested-PCR) с использованием внешних плазмидных праймеров (1L и 1R), а затем с помощью библиотечного праймера LP (Раунд 1, Рис. 2-А).

Известно, что интеграция ретровирусной ДНК происходит в основном в активно транскрибируемые области генома (Scherdin et al., 1990), поэтому гены, находящиеся в составе ретровирусного вектора, после интеграции в геном могут быть подвержены регуляции со стороны эндогенных цис-регуляторных элементов. Если таким элементом окажется энхансер, то в результате селекции отберутся фрагменты библиотеки, не обладающие энхансерной активностью (ложные энхансеры).

Чтобы снизить вероятность отбора ложных энхансеров мы проводили два раунда селекции. Для этого фрагменты библиотеки, амплифицированные с геномной ДНК популяции pQCXIX-Enh(L) после первого раунда селекции, снова клонировали в вектор pQCXIX-Enh. Количество выросших на этом этапе трансформантов составило около 10 тысяч. Из выросших клонов была выделена плазмидная ДНК, представляющая собой набор ретровирусных векторов с фрагментами библиотеки, прошедшими отбор в первом раунде селекции. Полученным набором векторов, а также контрольными векторами, снова трансфицировали клетки Phoenix-AMPHO и получали вирусные частицы. Полученными вирусными частицами инфицировали клетки HeLa для проведения второго раунда селекции.

После селекции из выживших клеток выделяли геномную ДНК и анализировали с помощью двухстадийной ПЦР (Раунд 2, Рис. 2-Б, стр. 8). На рисунке 2-Б видно, что на дорожке 4 (раунд 2) содержится меньше фрагментов ДНК, чем в исходной библиотеке (дорожка 2) и в библиотеке после первого раунда (дорожка 3), что свидетельствует об отборе последовательностей, обладающих энхансерной активностью.

Клонирование энхансер-подобных элементов и анализ выросших клонов E.coli.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.