WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Характеристика молекулярно-генетических причин возникновения синдромов прадера-вилли и энжельмена

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЕРМАКОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРИЧИН ВОЗНИКНОВЕНИЯ СИНДРОМОВ ПРАДЕРА-ВИЛЛИ И ЭНЖЕЛЬМЕНА

03.02.07 генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Немцова Марина Вячеславовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович
доктор биологических наук Петрова Ника Валентиновна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится « » 2010 г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при МГНЦ РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Р.А. Зинченко

Актуальность проблемы

Синдромы Прадера-Вилли (СПВ) и Энжельмена (СЭ) относятся к наиболее распространённым генетическим заболеваниям. Частота синдромов в различных популяциях составляет 1:10000-1:20000 новорожденных (Cassidy et. al., 2009; Van Buggenhout et. al., 2009). Эти заболевания известны, как генетические синдромы, связанные с нарушением импринтинга, их причиной являются повреждения различного генеза в блоке импринтированных генов, расположенных в 15q11-q13. Основными проявлениями этих заболеваний являются тяжелые неврологические расстройства в сочетании с умственной отсталостью, степень которой при СПВ может быть различной, а при СЭ достигает идиотии. Исходя из высокой частоты синдромов в популяции, разработка надежных методов ранней ДНК-диагностики СПВ и СЭ является задачей большой социальной значимости.

Исследование хромосомного набора пациентов с применением высокоразрешающих цитогенетических методов для диагностики этих наследственных синдромов, имеет ряд недостатков. Главными из них являются высокий риск ложноотрицательных результатов в связи с трудностями визуального обнаружения микроделеций критического района 15q11-q13, а также невозможность выявления функциональных нарушений этой хромосомной области, которые не сопровождаются структурными перестройками хромосомы 15.

Наиболее частой причиной возникновения СПВ и СЭ становится интерстициальная делеция критического района хромосомы 15q11-q13, которая обнаруживается у 70-75% пациентов. СПВ возникает в результате делеции на отцовской хромосоме, а СЭ - в случае делеции того же района на ее материнском гомологе.

Другой причиной развития этих синдромов является однородительская дисомия (ОРД). В 25% случаев при СПВ наблюдается однородительская материнская дисомия критического района 15q11-q13, наличие отцовской дисомии этого района приводит к возникновению СЭ в 5% случаев.

Кроме структурных и функциональных нарушений критического района существует ряд других причин, приводящих к развитию этих заболеваний. В 20% случаев при СЭ обнаруживаются точковые мутации в гене-кандидате UBE3A, который расположен в 15q11-q13 и имеет материнскую экспрессию. А также, причиной развития этих наследственных синдромов являются мутации и делеции в регуляторном элементе, названном центром импринтинга (ЦИ), которые выявляются у 2% пациентов. Определение мутаций в гене UBE3A и делеций/мутаций в ЦИ необходимо при медико-генетическом консультировании семьи и планировании рождения здорового потомства, поскольку именно эти генетические причины обуславливают максимальный риск повторного рождения ребенка с СПВ или СЭ.

Также имеются сообщения о вовлечении района q11-q13 хромосомы 15 в инвертированные дупликации, несбалансированные и сбалансированные транслокации и инверсии, которые могут приводить к возникновению СПВ и СЭ.

Многообразие молекулярных форм патологии, приводящих к развитию этих заболеваний, ставит вопрос о разработке адекватных методов диагностики, основанных на применении новейших молекулярно-генетических технологий. Разработка методов ДНК-диагностики СПВ и СЭ стала возможной благодаря новым сведениям о молекулярной организации критического района хромосомы 15, полученным при изучении геномного импринтинга у человека. В основу диагностического теста для СПВ и СЭ положена информация об особенностях аллельного метилирования в некоторых локусах критического района и его изменениях при этих заболеваниях. Разработка методологии и диагностического протокола для этих заболеваний позволит предложить новые подходы к медико-генетическому консультированию пациентов и их семей. Применение таких подходов является важной задачей, учитывая тяжелые неврологические проявления этих наследственных заболеваний, особенно при СЭ.



Разработка молекулярных методов диагностики позволят разделить наследственные и спорадические случаи этих тяжелых заболеваний и предложить пренатальную ДНК-диагностику в семьях, имеющих повышенный риск рождения детей с СПВ и СЭ.

Цель и задачи исследования

Цель: изучение структуры и частоты молекулярной патологии при синдромах Прадера-Вилли и Энжельмена и разработка ДНК - диагностического протокола для этих заболеваний.

Для достижения цели решались следующие задачи:

  1. Выявить структурные и функциональные нарушения критического района 15q11-q13, приводящие к развитию синдрома Прадера-Вилли в исследуемой выборке больных.
  2. Выявить структурные и функциональные нарушения критического района 15q11-q13, приводящие к развитию синдрома Энжельмена в исследуемой выборке больных.
  3. Исследовать мутации в гене UBE3A у пациентов с синдромом Энжельмена, у которых не выявлена патология импринтинга, и оценить их частоту.
  4. Разработать оптимальные подходы для молекулярно-генетической диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена.
  5. Разработать ДНК - диагностический протокол для пациентов с синдромами Прадера-Вилли и Энжельмена.

Научная новизна полученных результатов

Впервые предложен комплексный подход в молекулярно-генетической диагностике наследственных заболеваний, связанных с нарушением импринтинга в критическом районе 15q11-q13, который включает тест на исследование аномального метилирования промоторной области гена SNRPN, микросателлитный анализ локусов для дифференцировки делеции и однородительской дисомии, а также определение мутаций в гене-кандидате UBE3A для СЭ. В результате применения такого подхода к диагностике впервые появилась возможность определить весь спектр молекулярной патологии, включающий структурные и функциональные повреждения критического района 15q11-q13, приводящий к развитию СПВ и СЭ. Впервые в России проведен поиск мутаций в гене UBE3A у пациентов с клиническим диагнозом синдрома Энжельмена без нарушения аллельного метилирования импринтированных генов. Выявлено пять мутаций (IVS4-22del8, p.Cys21Tyr, p.Arg482X, p.Arg506Cys, c.2568_2571del4) и один полиморфный вариант (p.Ala178Thr) в разных экзонах гена UBE3A, одна мутация описана впервые. На основе полученных результатов впервые был предложен алгоритм исследования пациентов для выявления всех молекулярных нарушений, приводящих к развитию СПВ и СЭ.

Практическая значимость результатов исследования

В результате выполненной работы предложены эффективные методы молекулярно-генетической диагностики синдромов Прадера-Вилли и Энжельмена, которые могут быть использованы в медико-генетических центрах и клинических лабораториях в России. Применение этих методов позволяет определить все причины, приводящие к возникновению этих заболеваний у пациентов для разделения спорадических и наследственных случаев. Выявление мутаций в гене UBE3A, делеций/мутаций ЦИ или робертсоновских транслокаций (15;15) имеет исключительно важное значение для медико-генетического консультирования семьи и планирования рождения здорового потомства, поскольку именно эти генетические причины обуславливают максимальный риск повторного рождения ребенка с СПВ или СЭ. В представленной работе впервые проведено исследование спектра и частоты мутаций в гене UBE3A на выборке российских пациентов с СЭ. Впервые в России предложен полный и эффективный молекулярно-генетический протокол для диагностики СПВ и СЭ.

Положения, выносимые на защиту

  1. В структуре молекулярной патологии критического района 15q11-q13, связанного с геномным импринтингом, делеции и однородительские дисомии являются наиболее частыми причинами, приводящими к развитию СПВ и СЭ.
  2. В диагностике СПВ и СЭ необходимо использовать комплекс молекулярно-генетических методов для выявления нарушений импринтинга в критическом районе 15q11-q13, который включает: тест на исследование аномального метилирования промоторной области гена SNRPN, микросателлитный анализ локусов для дифференцировки делеции и однородительской дисомии, и определение точковых мутаций в гене UBE3A для пациентов с СЭ без нарушения метилирования импринтированных генов.
  3. Исследование спектра и частоты мутаций в гене UBE3A является необходимым для диагностики пациентов с СЭ при нормальном статусе метилирования импринтированных генов критического района.
  4. Разработка ДНК – диагностического протокола для СПВ и СЭ позволит выявить пациентов с различными формами молекулярной патологии и повысить эффективность диагностики и медико-генетического консультирования семей имеющих повышенный риск рождения детей с СПВ и СЭ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на расширенном заседании кафедры медицинской генетики РМАПО (Москва, 2009), представлены в материалах конференции молодых ученых, посвященной 80-летию РМАПО (Москва, 2010) и в материалах VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании ученого совета МГНЦ РАМН 20 апреля 2010 года.





Личный вклад автора в проведение исследования. Автор лично принимал участие в анализе отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, планировании экспериментов и получении основной части результатов. Автор самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из крови пациентов, проводил тесты для определения нарушения метилирования критического района 15q11-q13, микросателлитный анализ для дифференцировки делеций и однородительских дисомий в семьях пациентов с СПВ и СЭ. Также автор самостоятельно разработал протокол секвенирования и провел анализ мутаций в гене UBE3A у больных СЭ без нарушения импринтинга в критическом районе 15q11-q13. Принимал непосредственное участие в разработке диагностических протоколов для СПВ и СЭ. Автор сформулировал выводы и опубликовал статьи, отражающие основные результаты диссертационной работы.

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 4 печатных работах. Из них 2 статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ и 2 тезисов.

Внедрение результатов работы. Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в работу МГНЦ РАМН.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (155 наименований). Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В группу исследования были отобраны пациенты с клиническими признаками СПВ и СЭ. Пациенты направлялись из КПО МГНЦ РАМН, ДКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова, Московского Научно-исследовательского института педиатрии и детской хирургии (МНИИ).

Геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса выделяли стандартным методом (Sambrook et. al., 1989).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого многоканального амплификатора ДНК «Терцик» фирмы ДНК-Технология с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы «ИнтерЛабсервис» г. Москва. В работе была использована метилспецифическая ПЦР (МС-ПЦР), микросателлитный анализ, SSCP-анализ и прямое секвенирование ДНК.

Для проведения скрининга мутаций в гене UBE3A были сконструированы олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие кодирующие экзоны гена и прилегающие интронные области. Праймеры были подобраны с помощью программы Oligo 4.0 и отработаны оптимальные условия для проведения ПЦР. Для поиска точковых мутаций и полиморфных вариантов в транслируемых экзонах гена UBE3A использовали метод анализа SSCP (single strand conformation polymorphism) с температурной денатурацией и последующим разделением фрагментов в 8-10%-ном полиакриламидном геле. Визуализация результатов электрофореза проводилась с помощью стандартного метода окраски нитратом серебра.

При выявлении аномальных фрагментов ДНК проводили прямое секвенирование определенного участка экзона гена согласно протоколу ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits (“Applied Biosystems”, США). Результаты секвенирования анализировали при помощи программы Chromas и геномных баз данных NCBI и UCSC. Оценку влияния определенного структурного нарушения на вероятность возникновения/потери сайта сплайсинга проводили при помощи программы SpliceView (WebGene).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN

Для диагностики СПВ и СЭ на первом этапе использовали анализ аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN методом метилспецифической полимеразной цепной реакции (МС-ПЦР). Анализ был проведен у 100 пациентов с предварительным диагнозом СПВ и 50 пациентов с предварительным диагнозом СЭ. В результате проведенного исследования у 63 из 100 пациентов с клиническими проявлениями СПВ, был выявлен фрагмент длиной 131 п.н., соответствующий метилированному материнскому аллелю, при отсутствии отцовского неметилированного аллеля, длиной 164 п.н., утраченного вследствие делеции или однородительской дисомии. У 18 из 50 пациентов с СЭ наблюдался фрагмент длиной 164 п.н., соответствующий отцовскому неметилированному аллелю. Второй метилированный аллель утрачен в результате структурного или функционального нарушения в районе 15q11-q13 (рис. 1). Таким образом, молекулярный анализ выявил у этих пациентов молекулярно-генетические нарушения критического района, что подтверждает клинический диагноз у 63% пациентов с СПВ и у 36% пациентов с СЭ из исследуемой нами выборки (табл. 1).

 Анализ аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN-0

 Анализ аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN методом-1Рис. 1. Анализ аллельного метилирования промоторной области гена SNRPN методом метилспецифической ПЦР с двумя парами праймеров «Met» и «Unmet»

М – маркер длины фрагментов ДНК Puc19/HpaII

1,2,9,10 – фрагмент 131 п.н., соответствующий ПЦР-продукту, полученному с материнской хромосомы, метилированная форма. Подтверждает синдром Прадера-Вилли у пациентов.

3,4 – фрагмент 164 п.н., соответствующий ПЦР-продукту, полученному с отцовской хромосомы, неметилированная форма. Подтверждает синдром Энжельмена у пациентов.

5,6,7,8,11,12,13,14 – ПЦР-продукты 131 п.н. и 164 п.н., характерные для нормы.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.