WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Молекулярно-генетическая природа наследственной метгемоглобинемии

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ГАЛЕЕВА НАИЛЯ МАНСУРОВНА






МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРИРОДА НАСЛЕДСТВЕННОЙ МЕТГЕМОГЛОБИНЕМИИ


03.02.07 - Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Медико-генетический научный центр” Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

Дадали Елена Леонидовна, доктор медицинских наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, ведущий научный сотрудник научно-поликлинического отдела

Назаренко Мария Сергеевна, кандидат медицинских наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, научный сотрудник лаборатории популяционной генетики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «___» _______ 2012 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «_____»___________________ 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских

и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия (НЭМ) – редкое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное дефицитом системы восстановления метгемоглобина. Наиболее частой причиной НЭМ является нарушение работы фермента NADH-цитохром b5 редуктазы (метгемоглобинредуктазы). Выделяют первый тип заболевания, обусловленный нарушением работы растворимой формы фермента, и второй тип, обусловленный нарушением работы как растворимой, так и мембраносвязанной форм фермента. Наследственная метгемоглобинемия I типа имеет мягкое клиническое течение. Наследственная метгемоглобинемия II типа имеет более тяжелую клиническую картину и помимо цианоза, характеризуется микроцефалией, нарушением развития когнитивных и двигательных функций.

Клинически метгемоглобинемия I типа проявляется периодическими головными болями, головокружением, одышкой, тахикардией, быстрой утомляемостью, сонливостью, возможно, отставание в физическом и психическом развитии в результате постоянной гипоксии мозга. Повышение метгемоглобина (MetHb) до 10% чаще всего не дает клинически выраженных проявлений. При повышении MetHb в пределах 10–20% появляется цианоз слизистых и кожных покровов, возникают общая слабость, недомогание, ослабление памяти, раздражительность, головные боли. Лечение НЭМ I типа заключается в приеме аскорбиновой кислоты, при этом происходит снижение концентрации метгемоглобина, цианоз почти исчезает, улучшается самочувствие больных. Раннее начало лечения позволяет удержать уровень метгемоглобина сравнительно низким и, по возможности, избежать гипоксии мозга при его развитии. Лечение НЭМ II типа на сегодняшний день направлено только на поддержание нормального уровня метгемоглобина и купирование цианоза (Банщикова Е.С., 2002, Казанец Е.Г., 2009). У гетерозиготных носителей признаки заболевания отсутствуют, однако после приема метгемоглобинобразующих лекарственных препаратов (анальгетики, нитроглицерин, нитрофурагин, анестетики и т.д.) и при соприкосновении с некоторыми химическими веществами повышен риск развития токсической метгемоглобинемии экзогенного и эндогенного характера (Казанец Е.Г., 2009).

На сегодняшний день постановка диагноза НЭМ в РФ чаще всего проводится на основании данных анамнеза, осмотра, повышенного уровня метгемоглобина в крови, а также на основании биохимического анализа определения активности NADH-цитохром-b5-редуктазы в эритроцитах. Определение уровня активности метгемоглобинредуктазы в клинических лабораториях, являющееся важным биохимическим показателем в дифференциальной диагностике наследственной энзимопенической метгемоглобинемии, в настоящий момент затруднено в связи с отсутствием готовых наборов для данного исследования. Кроме того существование у биохимического метода “слепой зоны”, часто не позволяет отличать здоровых людей от гетерозиготных носителей заболевания (Банщикова Е.С., 2002).



Ранее наследственная метгемоглобинемия с заметным с раннего возраста цианозом очень часто давала повод к ошибочной диагностике у больных врожденного “синего” порока сердца (Дервиз Г.В., 1977). Сегодня, в связи с наличием современного оборудования, нарушения со стороны сердечнососудистой системы исключаются достаточно успешно, однако подтверждение диагноза “наследственная метгемоглобинемия” у таких больных затруднено. Наиболее актуальной на сегодняшний день проблемой является гипердиагностика НЭМ у новорожденных детей. Это связано с тем, что становление активности фермента метгемоглобинредуктазы завершается только к первому году жизни ребенка. Таким образом, до года по результатам биохимических исследований невозможно поставить точный диагноз у таких больных (Казанец Е.Г., 2009).

В России высокое распространение метгемоглобинемии I типа зарегистрировано у коренных жителей Республики Саха (Якутия) (Захарова Ф.А.,1982, Токарев Ю.Н., 1983, Банщикова Е.С., 2002). Оценена распространенность НЭМ I типа среди якутов, которая составила 1: 5677 человек (Тарская Л.А., 2004). Учитывая наличие накопления многих наследственных заболеваний у якутов, а также историческую информацию об их миграции и расселении, вероятной причиной распространения НЭМ I типа в Якутии является действие в данной популяции эффекта основателя (Серошевский В.Л., 1993, Банщикова Е.С., 2002). Наибольшее количество обследованных больных наследственной метгемоглобинемией проживает в центральной части Якутии, преимущественно в сельской местности, при этом самая высокая частота зарегистрирована в Вилюйской группе районов. В условиях Якутии гипоксия усугубляется дефицитом поступления витамина С с пищей (Банщикова Е.С., 2002).

В Якутии диагностика НЭМ I типа осуществляется при помощи биохимического исследования. Однако, учитывая наличие у данного метода недостатков часто не позволяющих установить точный диагноз, необходима разработка дешевого и быстрого молекулярно-генетического метода выявления мутации в том числе, в гетерозиготном состоянии, приводящей к НЭМ I типа в республике. ДНК-диагностика будет быстро и точно выявлять больных и гетерозиготных носителей заболевания, что позволит, в связи с наличием дешевого и доступного лечения, избегать нежелательных осложнений.

Цель исследования

Установить молекулярно-генетическую природу наследственной метгемоглобинемии у больных, проживающих в различных регионах Российской Федерации.

Задачи исследования:

  1. В выборке якутских больных провести анализ неравновесия по сцеплению НЭМ I типа с локусом гена CYB5R3.
  2. Установить молекулярно-генетическую причину наследственной метгемоглобинемии I типа в Республике Саха (Якутия) и разработать простые и доступные методы прямой ДНК-диагностики НЭМ I типа, пригодные для проведения популяционных исследований и ДНК-диагностики среди коренного населения республики Саха (Якутия).
  3. Определить частоту гетерозиготного носительства и расчетную частоту НЭМ I типа среди якутов.
  4. Подтвердить наличие эффекта основателя для НЭМ I типа среди якутов и выявить предковый гаплотип хромосом, несущих мутацию. Оценить «возраст» распространения мутации в якутской популяции.
  5. Установить молекулярно-генетическую причину наследственной метгемоглобинемии I и II типов у больных, проживающих в других регионах РФ.

Научная новизна

Впервые в России проведена полномасштабная работа, целью которой явилось выяснение молекулярно-генетических причин возникновения наследственной метгемоглобинемии у больных, проживающих в различных регионах РФ. Выявлены три новые мутации в гене CYB5R3, одной из которых оказалась крупная делеция - первая и единственная на сегодняшний день, обнаруженная в гене CYB5R3.

У народа саха впервые установлена молекулярно-генетическая причина НЭМ I типа. На основе разработанной системы, выявляющей обнаруженную мутацию, определена частота гетерозиготного носительства этой мутации (55:1000 или 1:18 человек) и расчетная частота заболевания (1:1250) в республике. Впервые на основании анализа гаплотипов подтверждено давнее предположение о существовании эффекта основателя для НЭМ I типа в Якутии и проведена оценка возраста распространения обнаруженной мутации (285± 135 лет). Полученный возраст не противоречит историческим данным и хорошо соотносится с результатами других работ, посвященных оценке возраста распространения других мутаций среди якутов.

Предложена и успешно применена на примере гена CYB5R3 стратегия поиска границ крупных делеций. Оценена доля крупных делеций в гене CYB5R3.

Практическая значимость

Определение молекулярно-генетической причины НЭМ I типа и последующая разработка методов ранней диагностики, позволяющей выявлять носителей заболевания, даст возможность, при правильном лечении, контроле приема препаратов и соблюдении диеты, избежать нежелательных осложнений. Учитывая очень высокую частоту носительства заболевания у народа саха, данная методика будет служить быстрым и удобным методом диагностики наследственной метгемоглобинемии I типа в Якутии.





Оценка «возраста» мутации, обнаруженной у якутов, внесет дополнительную ясность в понимание процесса этногенеза народа саха.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Причиной наследственной метгемоглобинемии I типа в Якутии является единственная мутация с.806С>Т в гене CYB5R3.
  2. Популяционная частота мутации с.806С>Т в гене CYB5R3 среди якутов составляет - 55:1000, а расчетная частота заболевания 1:1250.
  3. Распространение мутации среди якутов связано с дрейфом генов, возраст мутации для данной популяции составляет 285± 135 лет.
  4. У трех больных НЭМ обнаружены две новые мутации c.22-?_633+?del (делеция экзонов 2-7) и с.339dupC (p.Phe114LeufsX28) и одна ранее описанная мутация c.757 G>A (p.Val253Met).
  5. Предложен универсальный подход для поиска границ делеции, с помощью которого определены границы делеции с.22-1320_633+1224del в гене CYB5R3.
  6. Доля крупных делеций в гене CYB5R3 при НЭМ не превышает 20%.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на I Международной Пироговской конференции в 2006 году (г. Москва), на конференции European Human Genetics Conference 2006 (г. Амстердам, Голландия), на конференции "Генетика человека и патология" в 2007 году (г. Томск), на конференции European Human Genetics Conference 2008 (г. Барселона, Испания), на конференции European Human Genetics Conference 2009 (г. Вена, Австрия), на конференции European Human Genetics Conference 2012 (г. Нюрнберг, Германия).

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проанализированы данные отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации. Автор принимал участие в планировании и осуществил экспериментальную часть работы. Все этапы молекулярно-генетического исследования (выделение ДНК, генотипирование по полиморфным маркерам, поиск мутаций и создание систем их регистрации, анализ популяционных выборок) автором выполнены лично. Автором проведен анализ полученных результатов: статистическая обработка данных, вычисление возраста мутации, определение частоты гетерозиготного носительства и расчетной частоты заболевания, сформулированы выводы.

Публикации

По материалам исследования опубликованы 9 научных работ, среди них 3 статьи опубликованы в журналах, удовлетворяющих требованиям ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 106 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы. Библиографический указатель включает 92 наименования, из них 27 отечественных и 65 иностранных источника. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 21 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 16 больных и 8 здоровых родственников из 16 якутских семей с НЭМ I типа. Диагноз верифицировался в ФГБУ «НИИ медицинской генетики» СО РАМН города Томска. Также в работе использованы образцы крови 9 пациентов из 8 семей, страдающих метгемоглобинемией, поступившие в лабораторию ДНК-диагностики ФГБУ МГНЦ РАМН в период с 2006 по 2012 год. Диагноз верифицировался в Медико-генетической консультации самарской областной клинической больницы им. М.И. Калинина г. Самары, Перинатальном кардиологическом центре Городской Клинической Больницы №67 г. Москвы, Воронежской областной детской клинической больнице №1 г. Воронежа.

Популяционную выборку составили образцы ДНК 433 якутов, 32 коряков, 39 канадских эскимосов и 49 чукчей. Все индивидуумы считают себя коренными представителями соответствующих этнографических групп. Также для популяционного исследования использовали ДНК 12 человек из 4 ядерных неродственных семей больных ФКУ.

Образцы крови и ДНК использованы в работе с информированного согласия исследуемых лиц.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью готового набора реактивов фирмы DIAtomтм DNA Prep100 (Isogene Lab.ltd., Россия) по протоколу производителя.

Для исследований использовали 13 полиморфных маркеров, фланкировавших ген CYB5R3 в области размером 11,19 сМ по карте Marshfield ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).

Амплификацию необходимых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров. Дизайн праймеров выполнен в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ МНГЦ РАМН, фирма производитель – ООО “Синтол”, Москва, ЗАО“Евроген”, Москва.

Для ПДАФ- и ПДРФ- анализа использовали 7 и 8 % гель с соотношением акриламид: бисакриламид –29 : 1 и 29 : 1,3 с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении. В работе использовали эндонуклеазу AluI фирмы “Fermentas”, Литва.

Выявление изменений нуклеотидной последовательности гена CYB5R3 проводили путем автоматического секвенирования, которое проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystem, США).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.