WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Внеклеточная днк – фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Конькова Марина Сергеевна

ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК ФАКТОР СИГНАЛИЗАЦИИ ПРИ РАДИАЦИОННОМ ЭФФЕКТЕ СВИДЕТЕЛЯ

03.02.07 – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, Вейко Наталья Николаевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Конорова Ирина Львовна
доктор медицинских наук, Писарев Владимир Митрофанович

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП "ГосНИИгенетика")

Защита состоится ______________ 2011г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

Автореферат разослан ________________ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ещё два десятилетия назад эффекты радиации изучались у клеток, непосредственно подвергшихся действию частиц высоких энергий, и сводились к последствиям нерепарированных или неправильно репарированных повреждений ядерной ДНК после взаимодействия её с продуктами радиолиза воды. Эффекты в клетках, которые непосредственно не подверглись облучению, как правило, не рассматривались. Однако в последние годы ушедшего столетия начали появляться сообщения о способности клеток, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения в малых дозах, передавать сигнал необлучённым клеткам (клеткам-свидетелям), в результате и в тех, и в других индуцируются одинаковые эффекты (Nagasawa H., Little J.B., 1992). Эффект воздействия облучённых клеток популяции на необлучённые клетки получил название "bystander effect" или "эффект свидетеля" (ЭС) (Lehnert B.E., Goodvin E.H., 1997; Seymour C.B., Mothersill C., 1997).

Эффект свидетеля наблюдается преимущественно в интервале малых доз от 1 до 50 сГр (Morgan W.F., Sowa M.B., 2007). Для рентгеновского излучения ЭС тестируется уже при дозе 5 мГр, при этом уровень повреждений ДНК клетки-мишени включает всего пять однонитевых разрывов, 10-15 повреждённых оснований и один двунитевой разрыв ДНК в 20% клеток. Показано, что ЭС может передаваться от облучённых клеток потомству и проявляется в ряду нескольких последующих поколений клеток (Lyng F.M. et al., 2002, Mothersill C. et al., 2002).

Механизмы передачи клеткам-свидетелям информации о повреждающем воздействии активно изучаются, однако природа всех факторов сигнального пути до конца не известна. Основное внимание исследователей было сосредоточено на факторах белковой природы (Mothersill C., Seymour C.B., 2001; Nikjoo H., Khvostunov I.K., 2003), прежде всего, на различных цитокинах (Natarajan P.K. et al., 2007). Предполагалось также участие в передаче сигнала в ЭС активных форм кислорода и азота (Azzam E.I. et al., 2002; Matsumoto H. et al., 2007; 2010; Morgan W.F., 2010). В 2007 году сотрудниками лаборатории Молекулярной биологии МГНЦ РАМН было впервые высказано предположение о возможной роли внеклеточной ДНК в реализации эффекта свидетеля (Ермаков А.В. и соавт., 2007).

Цель исследования. Цель проведенного исследования – проверка гипотезы: внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых клеток (вкДНКR) переносит информацию о радиационном воздействии от облучённых клеток – необлучённым, т.е. выступает в роли фактора сигнализации при реализации эффекта свидетеля.

Задачи исследования.

  1. Выделить из среды культивирования облучённых лимфоцитов человека вкДНКR

и охарактеризовать её свойства;

  1. Определить возможный источник вкДНКR;
  2. Сравнить эффекты, индуцируемые в лимфоцитах человека ионизирующей

радиацией в малых дозах и депротеинизированной вкДНКR;

  1. Обозначить сигнальные пути, связанные с рецепторами, опознающими вкДНКR;
  2. Исследовать возможность моделирования свойств вкДНКR с целью

направленного изменения индуцируемых ею эффектов.

Научная новизна. Впервые показано, что вкДНКR выполняет функцию сигнального фактора в реализации эффекта свидетеля, индуцируемого ионизирующим излучением в малых дозах. Определены два условия, которые должны выполняться в клетках для поддержания данной функции вкДНКR: (1) синтез активных форм кислорода и азота и (2) апоптоз повреждённых радиацией клеток. Установлено, что вкДНКR стимулирует в лимфоцитах вторичный окислительный стресс. Впервые показано, что рецепторы "врождённого" иммунитета семейства TLR (TLR9) принимают непосредственное участие в ответе лимфоцитов на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах и в реализации эффекта свидетеля. Впервые показана принципиальная возможность моделирования клеточного ответа на действие радиации путем направленного изменения свойств внеклеточной ДНК.



Научно-практическая значимость работы. Данные о влиянии свойств вкДНК на клеточный ответ, индуцированный излучением, могут быть использованы при разработке индивидуальных схем радиотерапии. Моделируя содержание GC-богатых последовательностей (GC - ДНК) во вкДНК можно блокировать развитие адаптивного ответа и снизить летальную для клеток опухоли дозу радиации. С другой стороны, анализ индивидуальных свойств вкДНК и их направленное изменение может способствовать повышению радиорезистентности клеток (в перспективе, организма).

Положения, выносимые на защиту.

  1. Внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых лимфоцитов человека - фактор сигнализации при развитии эффекта свидетеля в клеточной популяции.
  2. Для проявления сигнальной функции вкДНК, в облучённых лимфоцитах должны соблюдаться два условия: синтез активных форм кислорода/азота и апоптоз облучённых клеток.
  3. В реализации сигнальной функции вкДНК в облучённых лимфоцитах принимают участие рецепторы TLR9.
  4. Ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения в малых дозах можно изменить путем варьирования содержания во вкДНК GC- богатых последовательностей ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на V и VI международных конференциях "Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum" (Москва, 2007; Гонконг, 2009); на II Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007); на Российской научной конференции "Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии" (Санкт-Петербург, 2008); на 37 международной конференции "37th Annual Meeting of the European Radiation Research Society" (Прага, 2009); на международной конференции "Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды" (Сыктывкар, 2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); на XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010); на VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010); на 4 международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 2010); на IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2011).

Диссертационная работа прошла апробацию на семинаре Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического центра РАМН, протокол № 3 от 16.03.2010.

Личный вклад автора. Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, определены задачи исследования и планирование экспериментов. Основная часть исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 печатная работа. Из них 8 статей опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 246 источников, из них 30 отечественных и 216 зарубежных авторов. Работа изложена на 151 листах машинописи. Текст содержит 39 рисунков и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании принимали участие 23 здоровых добровольца в возрасте от 19 до 55 лет. Лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования в системе фиколл-верографин, облучали на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Облучённые и необлучённые лимфоциты инкубировали в течение 3 ч при 370С (среда содержала 10% эмбриональной телячьей сыворотки). ВкДНК выделяли из среды культивирования стандартным методом экстракции органическими растворителями. Концентрацию фрагментов ДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) c использованием красителей Hoechst 33528 или PicoGreen. Для анализа действия вкДНК на интактные клетки в среду культивирования последних добавляли выделенные фрагменты вкДНК в различной концентрации и инкубировали в течение 3 ч при 370С.

Активность каспазы-3 (Акасп.3) в белковых экстрактах клеток определяли с использованием флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC (возб=400нм, флу=490нм). Активность нормировали на количество клеток. Для этого определяли количество ДНК в образце, из которого получали белковый экстракт. Акасп.3=IAFC/1мин.·1мкгДНК, где I – увеличение интенсивности флуоресценции субстрата (в стандартизованных единицах). Нуклеазную активность (НА) в белковых экстрактах определяли с использованием модельного субстрата – комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом, содержащим на 5-конце флуоресцентную группу (FAM), а на 3-конце тушитель флуоресценции. Для калибровки использовали стандартный раствор ДНКазы-1. НА=IFAM /1мин.·1мкгДНК. Активность TNF- в супертатантах определяли по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток мышиной фибросаркомы L-929 (Fish H., Gifford J.E., 1989), анализ выполнен к.б.н Е.А.Калашниковой. Концентрацию нитрита в среде определяли колориметрическим стандартным методом Грисса с использованием набора Griess Reagent Kit ("Invitrogen").





В работе использовали ингибиторы: (1) активности каспазы-3 (2 мкМ Biotin-DEVD-FMK ("Sigma)); (2) активных форм кислорода (АФК) (100 мкМ -токоферол ацетат ("Галено Фарм", Санкт-Петербург)); (3) рецепторов TLR9 (3 мкг/мл олигодезоксирибонуклеотид 2088 (TCC TGG CGG GGA AGT, "Синтол", Москва) или 2 мкг/мл хлорокин ("Boots Company PLC", Англия)).

Нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH). Лимфоциты обрабатывали гипотоническим раствором (0.075М KCl), фиксировали смесью метанол/ледяная уксусная кислота (3:1). Использовали биотинированный зонд на прицентромерный локус 1-й хромосомы (1q12). Гибридизацию осуществляли в термостате "ThermoBrite" ("StatSpin", США). Биотин выявляли конньюгатом авидин-ФИТЦ. Использовали микроскоп Axioplan ("Opton", Германия) и цифровую камеру "RETIGA 2000R" ("IMAGING", Канада). Определение параметров клеток проводили с помощью компьютерной программы анализа изображений ("ИнтерЭВМ", Москва). Для построения распределения параметров использовали данные для 300-500 клеток.

Селективная окраска азотнокислым серебром фиксированных ядер лимфоцитов проводилась к.б.н. Н.А. Еголиной (лаборатория общей цитогенетики МГНЦ РАМН). Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь в 150 - 200 интерфазных ядрах.

Содержание повторяющихся последовательностей генома (рибосомный и теломерный повторы человека и сателлит III) в ДНК определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации c биотинированными зондами (Вейко Н.Н. и соавт., 2003).

Оценка уровня экспрессии генов TLR9 и MyD88 методом ПЦР в реальном времени. РНК выделяли с использованием реагента Trizol. Концентрацию выделенной РНК определяли флуориметрически с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), возб=487 нм, флу=524 нм. Обратную транскрипцию проводили с помощью реактивов фирмы “Силекс” по стандартной методике. Для оценки уровня экспрессии TLR9 и MyD88 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по принципу TaqMan. В качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. ПЦР проводили на приборе Rotor Gene 300 (Corbett, Австр.). Полученные данные обрабатывали методом калибровочного графика и прямым сравнением данных с использованием программы прибора. Ошибка измерения составила ~ 2%.

Количество гиподиплоидных клеток в популяции лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии (окраска клеток пропидий йодидом) сотрудники ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА РФ.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics, Statistica 6.0 и StatPlus.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Свойства вкДНК облучённых и интактных лимфоцитов

Концентрация вкДНК в среде культивирования лимфоцитов (~0,5·106 клеток/мл среды) 23-х здоровых людей (вкДНКК) через 3 часа культивирования варьировала от 2 до 398 нг/мл среды. Данные о количестве вкДНК целесообразно выражать в процентах от суммарного количества ДНК, которая содержится в клетках и среде культивирования (МвкДНК). Для 22 образцов необлучённых лимфоцитов МвкДНК варьирует от 0.04 до 3.1% (среднее 1.3 ± 1.0%, N = 22). Для образца №23 наблюдалось аномально высокое количество вкДНКК (МвкДНК = 8%). Для лимфоцитов двух доноров (№23 и №5) была определена концентрация вкДНК соответственно 7 раз и 4 раза в течение 2-х лет. Для донора №23 количество вкДНК в среде культивирования оставалось на протяжении этого периода стабильно высоким (5 -10%), для донора №5 – стабильно низким (от 0.1 - 0.3 %).

После облучения лимфоцитов концентрация вкДНКR варьировала от 5 до 130 нг/мл среды (N = 23) или от 0.1 до 2.6 % от общего количества ДНК. Сравнение распределений МвкДНКR и МвкДНКК по критерию Манна-Уитни не выявило достоверных различий (p = 0.4; N = 23). Для лимфоцитов 4-х доноров отношение МвкДНКR/МвкДНКК достоверно больше 1 (от 2.5 до 7.1; 4.4 ± 2.2), для 4-х образцов концентрации вкДНКR и вкДНКК примерно одинаковы (p > 0.05). Для ~ 65% образцов детектировано достоверное снижение концентрации вкДНК после облучения (p < 0.05). Отношение МвкДНКR/МвкДНКК для этих образцов варьировало от 0.3 до 0.8 (0.6 ± 0.2; N = 15). Таким образом, облучение по-разному влияет на определяемые количества вкДНКR в среде культивирования лимфоцитов здоровых людей.

Содержание повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНКR по сравнению с вкДНКK было проанализировано методом сравнительной дот-гибридизации для лимфоцитов двух доноров (№5 и №23). Использовали ДНК-зонды на теломерный, рибосомный повторы и на повтор сателлит III (1q12). Содержание всех трёх повторов во вкДНКR не отличается от такового во вкДНКK (p > 0.1). Таким образом, не происходит существенного изменения состава последовательностей вкДНК после облучения лимфоцитов.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.