WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

Клинико-молекулярно-генетический анализ изолированных поясно-конечностных мышечных дистрофий, являющихся ферментопатиями.

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

РЫЖКОВА ОКСАНА ПЕТРОВНА

КЛИНИКО-молекулярно-генетический анализ ИЗОЛИРОВАННЫХ Поясно-конечностных мышечных дистрофий, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ферментопатиями.

03.02.07 генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2011

Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель – кандидат медицинских наук, Щагина Ольга Анатольевна
Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор, Дадали Елена Леонидовна
Официальные оппоненты – доктор медицинских наук, профессор, Петрин Александр Николаевич
доктор медицинских наук, профессор, Иллариошкин Сергей Николаевич
Ведущая организация – Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится «07» марта 2011г. в 14 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье,1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Актуальность темы

Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) – группа клинически полиморфных и генетически гетерогенных заболеваний, характеризующихся преимущественным поражением мышц тазового и плечевого поясов. Частота всех ПКМД колеблется в различных популяциях от 5 до 70 больных на 1 млн. населения (Дадали Е.Л., Щагина О.А, 2010). К настоящему времени описано 20 генетических вариантов ПКМД, которые подразделяются в зависимости от типа наследования на две подгруппы: ПКМД 1 типа с аутосомно – доминантным и ПКМД 2 типа - с аутосомно-рецессивным типом наследования. Большая часть выявленных случаев ПКМД (до 85%) наследуется по аутосомно-рецессивному типу (Ginjaard H.B., 2000). К настоящему времени практически все гены, ответственные за возникновение ПКМД, идентифицированы и определены белковые продукты их экспрессии. Установлено, что большинство этих продуктов являются частью саркомеры или сарколеммы мышечного волокна и, взаимодействуя друг с другом, формируют белковую цепь, обеспечивающую процесс сокращения и расслабления мышечного волокна (Vainzof М., 2008). Наряду с этим существует ряд белков, выполняющих роль ферментов, активирующих и синхронизирующих функции структурных белков в процессе мышечного сокращения и сигнальной трансдукции. На сегодня известно два основных фермента мышечного волокна: кальпаин 3 типа, мутации в котором приводят к возникновению ПКМД 2А типа, и фукутин-связанный белок, мутации в котором приводят к ПКМД2I типа (Tidball J.G. & Spencer M.J, 2000), (Esapa C.T., 2002).

Показано, что в большинстве европейских популяций наиболее распространенным генетическим вариантом ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования является 2A тип (OMIM: 253600), обусловленный мутациями в гене кальпаина 3 (CAPN3), на долю которого приходится от 30% до 40% всех случаев этой группы заболеваний (Canki-Klain N., 2004; Cobo A.M., 2004; Duno M., 2008). Вторым по частоте генетическим вариантом является ПКМД2I типа, обусловленная мутациями в гене FKRP который составляет от 6% до 38% аутосомно-рецессивных ПКМД в разных популяциях. Наиболее часто этот вариант ПКМД диагностируется в странах северной Европы (Hanisch F., 2005). Таким образом, по данным литературы в Европе на долю двух указанных ферментопатий приходится до 50% всех ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования.

Вследствие того, что белковые продукты генов, мутации в которых приводят к развитию аутосомно-рецессивных ПКМД, участвуют в одном патогенетическом процессе, клинические проявления всех генетических вариантов этой группы заболеваний характеризуется значительным сходством, что затрудняет их дифференциальную диагностику и снижает эффективность медико-генетического консультирования (Дадали Е.Л., 2004). Возникают трудности в установлении типа наследования заболевания в изолированных случаях, расчетах повторного риска рождения больного ребенка и планировании профилактические мероприятия в отягощенных семьях. Все это обуславливает необходимость создания алгоритма дифференциальной диагностики ПКМД с использованием молекулярно-генетических методов. Наличие такого алгоритма позволит определить очередность исследования мутаций в тех или иных генах, ответственных за развитие различных вариантов ПКМД, что существенно снизит экономические затраты при использовании дорогостоящих методов ДНК анализа. В основу такого алгоритма могут быть положены различия в частотах встречаемости отдельных генетических вариантов ПКМД и особенности их клинических проявлений. Проведение таких исследований наиболее целесообразно начинать с клинико-генетического анализа наиболее распространенных аутосомно-рецессивных вариантов ПКМД, к которым, по данным литературы, относятся две ферментопатии - ПКМД2А и 2I типов.



Однако до настоящего момента в РФ не проводилось исследований, направленных на определение вклада этих ферментопатий в общий спектр заболеваний с клинической картиной ПКМД и не анализировались особенности их клинических проявлений.

Цель исследования

Клинико-генетический анализ двух наследственных ферментопатий из группы ПКМД 2А и 2I типов и разработка алгоритмов их молекулярно-генетической диагностики на основании обследования выборки больных, проживающих на территории РФ.

Задачи исследования

  1. Определение частоты встречаемости ПКМД 2А и 2I, обусловленных мутациями в генах CAPN3, FKRP в выборке больных, проживающих на территории РФ.
  2. Разработка эффективных систем регистрации мутаций в CAPN3, FKRP генах и проведение анализа их спектра и частот встречаемости.
  3. Анализ частот встречаемости основных клинических симптомов характерных для различных вариантов ферментопатий, обусловленных мутациями в генах CAPN3 и FKRP.
  4. На основании полученных результатов и анализа литературных данных разработать алгоритм молекулярно-генетического диагностики распространенных ферментопатий из группы аутосомно-рецессивных ПКМД.

Научная новизна

Впервые в выборке больных с ПКМД, проживающих на территории РФ проведен анализ спектра и частот встречаемости мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за возникновение двух ферментопатий из группы мышечных дистрофий - ПКМД 2А и 2I типов. Установлен вклад мутаций этих генов в структуру заболеваемости ПКМД с АР типом наследования. Выявлено наличие «горячих» экзонов и мажорных мутаций в гене CAPN3 и FKRP и разработана система их регистрации. Впервые, на основании анализа гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель, определены причины распространенности частых мутаций и проведена оценка возраста возникновения мутации с.550delA, на долю которой приходится 49% всех мутаций в гене CAPN3 у российских больных с ПКМД 2А типом. На основании полученных оценок распространенности и особенности клинических проявлений двух ферментопатий из группы ПКМД, разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики распространенных ферментопатий у больных с ПКМД.

Практическая значимость

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики и протоколы ДНК-диагностики распространенных генетических вариантов аутосомно-рецессивных ферментопатий с фенотипом ПКМД. Созданы эффективные диагностические системы для выявления наиболее часто встречающихся мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за возникновение ПКМД 2А и 2I типов, позволяющие оптимизировать и значительно снизить затраты на проведение их молекулярно-генетической диагностики. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в практической работе врачей-генетиков и неврологов, работающих в области наследственной патологии нервной системы, а также в курсе лекций по клинической генетике на кафедрах генетики медицинских ВУЗов.

Положения, выносимые на защиту

  1. На долю ПКМД 2А типа, обусловленой мутациями в гене CAPN3 и ПКМД 2I типа, обусловленой мутациями в гене FKRP приходится 43% и 9% всех изолированных ПКМД соответственно.
  2. В выборке российских больных с ПКМД 2А типа выявлены две мажорные мутации гене в CAPN3 - с.550delA и с. 598-612del15, которые обнаружены в 35% случаев (23% мутантных аллелей). Показано, что причиной высокой частоты мутации с.550delA является эффект основателя. Возраст мутации составляет 1700±500 лет.
  3. Основной причиной возникновения ПКМД2I у больных, проживающих на территории РФ, является мутация Leu276Ile в гене FKRP.
  4. Не выявлены статистически достоверные отличия по частотам основных неврологических симптомов в группах больных с мутациями генов CAPN3 и FKRP, что свидетельствует о невозможности их разграничения только на клиническом уровне.
  5. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными ферментопатиями с клиникой ПКМД и эффективные системы диагностики частых мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за их возникновение.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010, на конференции European Human Genetics Conference 2010, на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009, на конференции European Human Genetics Conference 2009.





Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, сформирована группа обследования. Автор лично принимал участие в планировании экспериментов. Автор самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, проводил поиск мутаций, генотипирование контрольной выборки на неописанные ранее точечные замены, анализ гаплотипов хромосом с частыми мутациями в генах CAPN3 и FKRP. Автором разработана система диагностики 2 частых мутаций гена CAPN3, разработан алгоритм молекулярно-генетического анализа больных изолированной ПКМД из РФ. Автор провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 8 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы по анализу генетического и фенотипического разнообразия распространенных ферментопатий в группе ПКМД были внедрены в практику медико-генетического консультирования при МГНЦ РАМН.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение собственных исследований, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 89 источников: 1 отечественный и 88 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 20 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 75 неродственных больных в возрасте от 4 до 36 лет (30 мужчин и 45 женщин), с диагнозом поясно-конечностная мышечная дистрофия и 14 их клинически здоровых родственников, живущих в разных регионах РФ. Шесть пациентов имели подтвержденный аутосомно-рецессивный тип наследования (семейные случаи), остальные случаи заболевания были спорадическими. Диагноз ПКМД верифицирован врачами-генетиками Медико-генетического научного центра РАМН, а так же Воронежской медико-генетической консультации.

Контрольную выборку составили 100 образцов (200 хромосом) полученных от неродственных индивидов различных регионов РФ. Кроме того, в качестве группы сравнения для расчета возраста мутации использованы образцы ДНК членов 24 ядерных семей (96 хромосом) из различных регионов РФ

Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom TM из образцов периферической крови.

Исследование генов CAPN3 и FKRP проводили с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-интронных соединений. Амплификацию необходимых фрагментов геномной ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Все фрагменты были секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator’s v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проводили с помощью программы Chromas.

При выявлении у пациентов ранее неописанных нуклеотидных замен, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях, исследованы частоты их встречаемости в контрольной группе методом мультиплексной пробзависимой лигазной реакции.

При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене CAPN3 выбраны 7 микросателлитных маркеров с высокой гетерозиготностью, расположенных в области размером 5791 т.п.н. (3,22 сМ) вокруг гена CAPN3, 4 из которых расположены в сторону центромеры от гена и 3 – в сторону теломеры. При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене FKRP выбрано четыре микросателлитных маркера с высокой гетерозиготностью, расположенных в интервале 1980 т.п.н. (2,58 сМ) вокруг гена FKRP, два из которых расположены в сторону центромеры от гена и два в сторону теломеры. Так же для построения гаплотипа использованы внутригенные маркеры (FKRP 3’ GT – двухнуклеотидный повтор в 3’ области гена и полиморфизм c.135C>T (rs2287717)). Для каждого из маркеров были выбраны и синтезированы пары праймеров. Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении.

При сравнении частот аллелей в хромосомах с мутацией и в популяционных хромосомах использован 2 тест для двупольной таблицы, а так же точный критерий Фишера для случаев, когда критерий 2 неприменим при малом числе наблюдений.

Для оценки неравновесности по сцеплению использовали oценку = (PD – PN)/(1 – PN), где - мера неравновесности сцепления, PD – частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, PN – частота этого же аллеля среди нормальных хромосом (Bengtsson B.O., 1981), c доверительным интервалом, предложенным Diaz G.A. с соавт. (2000).

Для определения возраста частой мутации гена CAPN3 с.550delA применяли один из подходов, основанных на понятии «генетических часов» (Labuda D., 1997), и оценивающий количество поколений g (Rish N., 1995) с момента появления мутации в популяции до настоящего времени, исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени.


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.