WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Молекулярно-генетический анализ особенностей структуры и экспрессии генов brca1/2 при раке яичников и молочной железы

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ШУБИН ВИТАЛИЙ ПАВЛОВИЧ

Молекулярно-генетический анализ особенностей СТРУКТУРЫ И экспрессии генов brca1/2 при раке яичников и молочной железы

03.02.07 – генетика

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель – Доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич
Официальные оппоненты – доктор биологических наук, профессор Сломинский Пётр Андреевич
доктор биологических наук, профессор Брага Элеонора Александровна
Ведущая организация – Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Защита состоится « » 2011г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан « » 2011г.

Учёный секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Актуальность исследования

Рак яичников (РЯ) и молочной железы (РМЖ) являются наиболее распространенными заболеваниями женской репродуктивной системы в развитых странах. За пятилетний период 2001-2006 гг. отмечен заметный прирост заболеваемости опухолями яичников в России – на 5,8% (Давыдов М.И и Аксель Е.М., 2009). Одновременно растёт и смертность от РЯ. Рак этой локализации имеет один из самых высоких показатели смертности среди всех гинекологических опухолей.

Одним из факторов риска развития РЯ является онкологически отягощенный семейный анамнез. Основная доля наследственной формы РЯ обусловлена мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Спектры и частоты мутаций в указанных генах зависят от этнической принадлежности и географического положения популяций. Информация об этих характеристиках важна с точки зрения понимания процессов возникновения и распространения мутаций и необходима для решения практической задачи – профилактики рака. Примерно 70% диагностированных случаев РЯ приходится на 3-4 стадию развития опухоли яичников. Это обстоятельство влияет на уровень тяжких последствий при этом заболевании и дополнительно акцентирует значимость выявления женщин с мутациями в генах BRCA1/2 и проведения в дальнейшем динамического диспансерного наблюдения. Кроме того, присутствие у больного РЯ мутации в гене BRCA1 может являться фактором, влияющим на выбор средств терапии.

Однако наследственная форма занимает хотя и существенную, но меньшую долю всех случаев РЯ, по сравнению со спорадической формой этого заболевания. Молекулярные причины возникновения спорадических случаев РЯ в настоящее время не ясны. В недавней работе Alimonti A. с соавт., (2010) показано возникновение рака при снижении экспрессии гена-супрессора в опухоли, причем для этого было достаточно снижения экспрессии на 30%. Такое влияние частичной потери функции гена-супрессора может иметь широкое распространение, и нуждается в дальнейшем исследовании (Berger A.H. et al., 2011). Супрессорами спорадической формы РЯ могут быть те же гены - BRCA1/2 (Bowtell D.D, 2010). Прояснению значения генов BRCA1 и BRCA2 для возникновения и развития спорадической формы РЯ может способствовать изучение характеристик их экспрессии в раковой опухоли. Необходимость такого исследования усиливают накапливающиеся в последнее время данные о наличии популяционных различий характеристик экспрессии генов в опухоли (Patel T.A et al., 2010). Дополнительный свет на участие генов BRCA1 и BRCA2 в опухолевом росте может пролить сравнительный анализ экспрессии генов при РЯ и связанном с этими генами раком другой локализации – раке молочной железы. Этот аспект существенен также в плане данных о взаимодействии генов BRCA1 и рецептора эстрогена (ESR1) при раке молочной железы. Именно такое взаимодействие рассматривается как определяющее органоспецифичность супрессорной функции гена BRCA1 (Gorsky B. et al., 2009). В то же время, данные о взаимодействии генов BRCA1/2 с ESR1 при раке яичников отсутствуют. Исследование в этом направлении, при выявлении особенностей взаимодействия указанных генов при РЯ, могло бы дать дополнительную информацию о причинах различных локализаций рака при одном и том же гене-супрессоре. В связи с этим, представлялось также целесообразным изучить важные для развития рассматриваемых типов рака гены рецептора эстрогена (ESR1) и остеопонтина (OPN), которые могут быть взаимосвязаны на уровне регуляции с геном BRCA1.



В последнее время большое значение для роста опухоли связывают с процессами, происходящими в прилегающей к ней ткани и которые функционально могут быть связаны с процессами в опухоли (Wang E. et al., 2005; Goetz J.G. et al., 2011). Эта важная для понимания развития опухоли область исследований находится в процессе изучения.

Цель исследования

Изучение особенностей структуры и экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 при раке яичников и молочной железы.

Задачи исследования

1. Исследовать спектр и частоту мутаций в гене BRCA1 в неселектированной выборке больных РЯ в Республике Мордовия.

2. Провести исследование экспрессии генов BRCA1, BRCA2, ESR1 и OPN в злокачественной опухоли яичников и сравнить с экспрессией этих генов при РМЖ.

3. Изучить экспрессию генов BRCA1, BRCA2, ESR1 и OPN в ткани ближайшего окружения опухоли при РЯ.

4. Изучить взаимосвязь уровней экспрессии генов BRCA1, BRCA2, ESR1 и OPN в злокачественных опухолях яичников и молочной железы и в ткани ближайшего окружения опухоли яичников.

Научная новизна полученных результатов

Впервые изучены частота и спектр мутаций в гене BRCA1 в Республике Мордовия. Выявленная частота мутаций в гене BRCA1 при РЯ составила 26% и относится к наиболее высокой в неселектированных выборках больных из других популяций. В спектре преобладают две мутации - 3819del5 и 5382insC.

Результаты гаплотипирования по микросателитным маркерам могут свидетельствовать в пользу распространения мутации 3819del5 вследствие эффекта основателя.

Получены данные о пониженном уровне экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли спорадической (без наличия герминальной мутаций в данном гене) формы РЯ. Обнаружен повышенный уровень экспрессии гена BRCA2 в злокачественной опухоли молочной железы.

Впервые установлена корреляция уровней экспрессии гена BRCA2 с уровнями экспрессии генов ESR1 и OPN в злокачественной опухоли яичников.

Впервые найдены координированные изменения уровней экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли яичников и ткани её ближайшего окружения.

Практическая значимость

Полученные данные о частоте и спектре мутаций в гене BRCA1 при РЯ необходимы для выявления наследственной предрасположенности к раку указанной локализации с целью его профилактики и указывают на возможность и целесообразность проведения скрининговых исследований больных РЯ в Мордовии.

Данные о пониженном уровне экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли спорадической формы РЯ указывают на значение этого гена для развития не только наследственной, но и спорадической формы РЯ. Эти результаты, наряду с данными о повышенном уровне экспрессии гена BRCA2 в опухоли при РМЖ могут быть в дальнейшем использованы при разработке маркеров указанных типов злокачественных новообразований.

Полученные новые данные по функционированию генов в ткани ближайшего окружения опухоли важны для понимания взаимодействия опухоли и ее микроокружения и могут быть востребованы при разработке новых способов терапии РЯ и при хирургическом вмешательстве.

Положения, выносимые на защиту

1. Выявленная частота мутаций в гене BRCA1 при РЯ в Мордовии, составившая 26%, относится к наиболее высоким частотам, найденным в неселектированных выборках больных из других популяций.

2. В спектре мутаций в гене BRCA1 при РЯ в Мордовии преобладают две мутации - 3819del5 и 5382insC. Результаты гаплотипирования по микросателитным маркерам демонстрируют общий гаплотип при мутации 3819del5, что может свидетельствовать в пользу распространения этой мутации вследствие эффекта основателя.

3. Уровень экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли спорадической формы РЯ в основном числе случаев понижен. В злокачественной опухоли молочной железы уровень экспрессии гена BRCA2 в основном повышен. Уровень экспрессии гена BRCA2 коррелирует с уровнями экспрессии генов ESR1 и OPN в злокачественной опухоли яичников. При раке молочной железы обнаружена корреляция уровней экспрессии генов BRCA1 и ESR1.

4. Существуют координированные изменения уровней экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли яичников и ткани ее ближайшего окружения.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы представлены и обсуждены на российских и международных конференциях и съездах: IV съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), European Human Genetics Conference (Вена, 2009; Гетеборг, 2010; Амстердам, 2011).

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара МГНЦ РАМН 28 сентября 2011 года.

Личный вклад автора в проведение исследования

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов их выполнения, проведении исследований, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи.





Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 9 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата наук.

Объем и структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 117 источников: 8 отечественных и 109 зарубежных. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 11 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Группа больных РЯ для исследования мутаций в генах BRCA1/2 была сформирована из 65 женщин, проживающих в Республике Мордовия, только на основании соответствующего диагноза без учета семейной истории заболевания. Основное число больных РЯ, 36 человек, составили русские (не исключено присутствие мордовских корней), 15 мордовок, 14 относили себя к другим национальностям. Возраст больных находился в интервале 25 – 70 лет, все являлись коренными жителями Республики Мордовия. Сбор образцов крови пациентов и анализ семейной истории осуществлены при участии сотрудников республиканского онкологического диспансера г. Саранска Волковой О.В. и Мельцаева Г.Г.

Для анализа экспрессии генов при РЯ была сформирована выборка из образцов ткани от 19 больных (57 образцов). Средний возраст пробандов составлял 49 лет. Опухоль характеризовалась как серозно-папилярная аденокарцинома 3 стадии развития заболевания (Т3сNоМо). Экспрессию исследовали в образцах опухоли, прилегающей к ней гистологически нормальной ткани, а также отдаленной на максимальном расстоянии от очага опухоли ткани этого же органа, полученных от того же пациента. Сбор образцов проводился при участии сотрудников РОНЦ РАМН Грицая А.Н. и Кашурникова А.Ю. Экспрессию генов при РМЖ исследовали в образцах злокачественной опухоли молочной железы и гистологически нормальной ткани, максимально отдаленной от опухоли, того же пациента (19 пациентов; 38 образцов). Все образцы опухоли характеризовались как инфильтративный протоковый рак второй степени злокачественности и 3 стадией развития. Средний возраст пробандов 52 года. Сбор образцов проводился при участии сотрудников РОНЦ РАМН Ким Е.А. и Высоцкой И.В. У пациентов получено письменное информированное согласие на проведение исследования.

Определение мутаций в генах BRCA1/2 проводили с помощью конформационно-чувствительного электрофореза - CSGE, который обладает высокой чувствительностью и универсальностью, с последующим подтверждением наличия мутации и выявлением ее характеристик путем секвенирования. В гене BRCA1 исследованы все экзонные участки с прилегающими участками интронов; в гене BRCA2 - 9, 15, 23 и 11 (nt 5886-6420) экзоны, в которых встречались мутации в странах с населением, входящим в состав финно-угорских народов.

Уровень экспрессии генов BRCA1, BRCA2, OPN и ESR1 измеряли с помощью ПЦР в реальном времени (StepOnePlus, ABI, США), используя фирменный набор TaqMan, либо, в некоторых случаях, краситель Sybr Green. Для определения экспрессии использована стандартная оценка Сt. Суммарная РНК выделена с помощью набора YellowSolve. Качество выделения РНК проверяли электрофоретически. Обратную транскрипцию проводили, используя набор ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США). Для каждого гена определена область линейности экспрессии. Анализ экспрессии проводили, используя стандартный метод Ct.

Статистический анализ выполняли с помощью стандартного пакета «Statistica» (версия 6.0, «Statsoft Inc.», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение пациентов с раком яичников на наличие мутаций в генах BRCA1/2

В гене BRCA1 у пробандов обнаружено 4 мутации (3819del5, 5382insC, 4154delA, C61G) и два миссенс-варианта R1347G, R841W. В гене BRCA2 мутаций не обнаружено.

На рис. 1 показана последовательность нуклеотидов участка ДНК с наличием мутации 3819del5 и электрофоретическое разделение данного фрагмента ДНК. При этой мутации происходит делеция пяти нуклеотидов GTAAA в 11 экзоне гена BRCA1. В результате сдвига рамки считывания в 11 экзоне образуется стоп-кодон в положении 1242.

Среди 65 мордовских больных РЯ мутации в гене BRCA1 обнаружены у 17 больных (26%). Обнаруженная частота мутаций в гене BRCA1 среди мордовских больных РЯ относится к наиболее высоким. Самая высокая частота мутаций в неселектированной выборке РЯ ранее наблюдалась у евреев ашкенази (30%) и в Белоруссии (26%) (Bogdanova NV et al., 2010). В выборках больных, исследованных в других странах, частота мутаций в гене BRCA1 ниже. В Европе данная частота изменялась от 7,4% (Швеция) до 12,9% в Польше и 14,8% в Московском регионе (Смирнова Т.Ю и др., 2007). Найденная частота мутаций значимо не отличается от частоты среди евреев ашкенази, но выше, чем у поляков и в Московском регионе (р=0,02).

 А Б Определение изменений первичной структуры-0

А Б

Рис.1. Определение изменений первичной структуры ДНК гена BRCA1.

Примечание: А – Фрагмент результата секвенирования 11 экзона гена BRCA1. В последовательности ДНК одного аллеля обнаружена делеция 5 нуклеотидов в положении 3819 нуклеотидной последовательности (1 – норма; 2 – мутация).

Б – Электрофоретическое разделение методом CSGE амплифицированных фрагментов ДНК гена BRCA1 (11 экзон) у больной РЯ и двух контролей. Стрелкой указана дорожка с образцом ДНК больной РЯ с мутацией.

Полученные в настоящей работе характеристики спектра мутаций при РЯ в гене BRCA1 (рис.2) отличаются от спектра, выявленного в Московском регионе (рис. 3) (Смирнова Т.Ю. и др., 2007).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.