WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |

Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты

-- [ Страница 1 ] --



На правах рукописи

СТРЕЛЬНИКОВ

Владимир Викторович

Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований:

фундаментальные и прикладные аспекты

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук


Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович


Официальные оппоненты:

Носиков Валерий Вячеславович, доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля» Российской академии наук, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-биологических исследований


Фаворова Ольга Олеговна, доктор биологических наук, профессор

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой молекулярной биологии и медицинской биотехнологии


Иващенко Татьяна Эдуардовна, доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (Санкт-Петербург), ведущий научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний


Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «___» _______ 2012 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.


Автореферат разослан «______»___________________ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Значительная часть современных представлений о злокачественных новообразованиях основывается на предположении о том, что они развиваются в результате выхода клеток из-под контроля механизмов регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие накопления соматических мутаций (Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Stratton M.R. et al., 2009). Наличие соматических мутаций, в число которых входят как структурные повреждения (нуклеотидные замены, небольшие инсерции и делеции, хромосомные перестройки, численные аномалии), так и эпигенетические нарушения, – неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований (Pleasance E.D. et al., 2010).

Новейшие технологии полногеномного анализа ДНК позволяют определять практически все классы структурных соматических изменений на всем протяжении генома (Mardis E.R. et al., 2009; Beroukhim R. et al., 2010). Полногеномный анализ структурных изменений, основанный на методах секвенирования нового поколения, обеспечивает получение результатов с точностью до одного нуклеотида. Фактически дальнейшее развитие этой области исследования соматических мутаций в ближайшее время будет сводиться к совершенствованию существующих технологий (Ding L. et al., 2010; Lee W. et al., 2010).

К полногеномному анализу метилирования ДНК методы секвенирования нового поколения на сегодняшний день применимы в очень незначительной степени, что объясняется в первую очередь сниженной информативностью последовательностей бисульфит-модифицированной ДНК, используемой в качестве матрицы для секвенирования (Stratton M.R. et al., 2009). Неметилированные участки ДНК после бисульфитной конверсии представляют собой последовательности из трех нуклеотидов, что значительно осложняет выравнивание фрагментов при формировании контигов; кроме того, прямые и обратные прочтения конвертированной ДНК не являются обратно комплементарными (Tost J., Gut I.G., 2007; Xi Y., Li W., 2009; Huss M. 2010). Таким образом, достоверная информация о характере метилирования ДНК с однонуклеотидным разрешением на сегодняшний день может быть получена только с использованием традиционных методов локус-специфического анализа, осуществление которого требует формирования принципов отбора кандидатных геномных локусов.



При разработке стратегия отбора кандидатных локусов для детальной характеристики метилирования следует принять во внимание все существующие возможности скрининга характеристик эпигеномов. Подходы к таким исследованиям не универсальны. Одни из них обеспечивают анализ с полногеномным покрытием, но низким разрешением; другие, при высоком разрешении, позволяют анализировать ограниченные выборки участков генома.

К первой группе относятся методы, основанные либо на аффинном обогащении фрагментированной ДНК фракциями с определенными эпигенетическими характеристиками, либо на обработке препаратов ДНК различными типами нуклеаз. Таким образом можно проанализировать не только метилирование ДНК (Weber M. et al., 2005), но и химические модификации хроматина - гистоновые метки H3K4Me1, H3K27Ac, H3K4Me3 (Heintzman N. D. et al., 2009), области доступного хроматина (Crawford G.E. et al., 2006; Boyle A.P. et al., 2008), плотность нуклеосомной упаковки (Dennis J.H. et al., 2007). Надежно определяя эпигенетические изменения на полногеномном уровне, указанные методы страдают низкой прецизионностью: исследуемые параметры характеризуются с разрешением около 100-200 нуклеотидных пар (Huebert D.J. et al., 2006; Crawford G.E. et al., 2006; Johnson D.S. et al., 2008; Serre D. et al., 2009).

Вторая группа подходов подразумевает скрининг дифференциального метилирования ограниченных выборок геномных локусов. В этой группе наиболее известны методы метилчувствительного рестрикционно-ориентированного геномного сканирования (Rush L.J. et al., 2001; Costello J.F. et al., 2009), метилчувствительного репрезентативно-дифференциального анализа (Ushijima T. et al., 1997), метилчувствительного фингерпринтинга (Gonzalgo M.L. et al., 1997), амплификации интерметилированных сайтов (Frigola J. et al., 2002). Огромным преимуществом перечисленных методов является непредвзятость скрининга, под которой понимается определение дифференциального метилирования заранее неизвестных локусов генома с последующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Непредвзятость скрининга - краеугольный камень объективной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard et al., 2006). В то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует (Bock, C., 2009). Указанные методы, разработанные более 10 лет назад, так и не нашли широкого применения. Требуется формирование принципиально новой концепции, учитывающей современный уровень генетических знаний и использующей преимущества завершения проекта по секвенированию генома человека.

Сопоставление результатов исследования полногеномного и локального метилирования ДНК и ряда характеристик хроматина в пределах хромосомных участков должно привести к формированию синтетического подхода к изучению метиломов злокачественных новообразований, который будет полезен как с точки зрения изучения фундаментальных основ эпигенетической регуляции при канцерогенезе, так и с точки зрения разработки молекулярно-генетических клинических диагностических маркеров. Применительно к фундаментальным и прикладным аспектам онкогеномики требуется разработка методологии анализа эпигеномов злокачественных новообразований на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, медицинской биотехнологии, математического моделирования и биоинформатики.

Цель работы. Разработать оригинальную методологию скрининга дифференциального метилирования геномов и применить её к изучению фундаментальных характеристик метиломов злокачественных новообразований.

Задачи исследования.

  1. Разработать оригинальную методологию непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, математического моделирования и биоинформатики.
  2. Охарактеризовать состав репрезентаций генома, генерируемых разработанными методами скрининга районов дифференциального метилирования геномов.
  3. Идентифицировать новые гены и локусы, вовлеченные в канцерогенез и подверженные аномальной эпигенетической регуляции при раке.
  4. Провести анализ молекулярной патологии наиболее перспективного гена-кандидата на роль супрессора опухолевого роста из набора новых генов, выявленных в процессе исследования.
  5. Идентифицировать константно метилированные участки генома человека, которые могут служить основой для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.
  6. Охарактеризовать локальные параметры хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе.
  7. Сформировать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации.
  8. Используя разработанный способ предсказания статуса метилирования участков генов, вовлеченных в канцерогенез, провести исследования эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов субъединиц ламининов).

Научная новизна.





Разработана оригинальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов AFLOAT (анализ, ориентированный на длину амплифицируемых фрагментов). Предложены принципиальные модификации методов поиска дифференциального метилирования – метилчувствительного фингерпринтинга и амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС. Выявлено 26 новых локусов, дифференциально метилированных в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Из них 22 принадлежат генам LAMB1, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF1, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Четыре дифференциально метилированных района расположены в межгенных областях на хромосомах 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1. Проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов рака молочной железы (РМЖ). Впервые выявлена герминальная мутация SEMA6B у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SEMA6B – один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров впервые выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного 3’-концевого экзона, первым экзонам генов LAMA3A, LAMB3, LAMC3, интронным областям генов MAD1L1, TAF4 и 3'-CpG-островку гена ZBTB4.

Впервые проведено исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов цепей ламининов). Шесть из них демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 – 36%, LAMA2 – 38%, LAMA3B – 6%, LAMA4 – 2%, LAMB1 – 16%, LAMC3 – 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время как образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей двух генов субъединиц ламининов – LAMA3A и LAMB3.

Впервые проведенный прицельный анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков – с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков – с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки.

Теоретическая и практическая значимость.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.