WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 9 |

Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты

-- [ Страница 4 ] --

Для обеспечения обоснованного дизайна экспериментов АИМС путем предварительного моделирования ожидаемых результатов разработана программа компьютерной симуляции «AIMS in silico». Алгоритм работы программы заключается в следующем. На первом этапе моделируется полный набор фрагментов ДНК, получаемых при обработке исследуемого генома основной рестриктазой АИМС (в классическом варианте это – XmaI). Фактически этот набор - полная репрезентация АИМС, представляющая собой субстрат для дальнейших исследований in silico с целью моделирования возможных результатов АИМС в реальном эксперименте при различных удлинителях универсального праймера. В дальнейшем полная репрезентация виртуально подвергается лигированию с предложенным пользователем адаптером и амплифицируется с универсальным праймером, содержащим заданный удлинитель. Таким образом, алгоритм моделирования результатов экспериментов практически воспроизводит протокол осуществления АИМС in vitro. С использованием разработанной компьютерной программы охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методом АИМС. Количественная иерархия продуктов в зависимости от длин и нуклеотидного состава удлинителей универсальных праймеров представлена в виде гистограммы на рис. 4. Гистограмма ясно демонстрирует ошибочность постулата авторов метода АИМС о том, что при прочих равных условиях добавление каждого дополнительного нуклеотида к универсальным праймерам предполагает снижение сложности результирующей картины в 5 раз для C,G и в 3 раза для A,T. Важно, что экспериментальное определение параметров, представленных на рис. 4, потребовало бы невероятных затрат труда, времени и материалов, а неопределение наверняка привело бы к ложной интерпретации опытных данных.




Рис. 4. Иерархическая диаграмма продуктов АИМС, предсказанных для следующих условий эксперимента: сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции C^CCGGG, удлинители всех типов от 0 до 3 нуклеотидов, длина анализируемых продуктов АИМС – до 1 тыс. нуклеотидов. Синим цветом обозначено общее количество первичных фрагментов (при отсутствии удлинителей) – около 100 тыс. Красным указаны количества продуктов, получаемых при использовании однонуклеотидных удлинителей, желтым – двухнуклеотидных, зеленым – трехнуклеотидных. Ось абсцисс представляет собой логарифмическую шкалу, поскольку разница в количестве фрагментов составляет от 1 до 100000. (В соавторстве с А.С.Танасом).

Для визуализации, анализа и дифференциации капиллярных электрофореграмм, полученных на автоматических генетических анализаторах и представленных в файлах *.fsa формата ABIF, разработана компьютерная программа PeakPick (рис. 5). Важнейшей функцией программы PeakPick является осуществление дифференциального анализа электрофореграмм репрезентаций различных геномов (нормального/опухолевого геномов, геномов организмов разных штаммов/сортов/видов) для определения степени генетического сходства/различия исследуемых образцов биологического материала. Эта опция делает программу незаменимой при проведении сравнительного анализа геномных фингерпринтов.

 Фрагмент окна сравнительного анализа электрофореграмм-3




Рис. 5. Фрагмент окна сравнительного анализа электрофореграмм компьютерной программы PeakPick.

Традиционный дизайн АИМС предполагает клонирование и секвенирование интересующих фрагментов ДНК для определения их геномной принадлежности. Поскольку определение нуклеотидной последовательности генома человека практически полностью завершено и, соответственно, последовательности возможных продуктов АИМС также известны, этапы клонирования и секвенирования были заменены последовательными этапами рестриктазного картирования in silico и in vitro.

Для моделирования рестриктазного картирования был введен дополнительный модуль в программу AIMS in silico. Моделирование проводится на основе полной репрезентации АИМС, предсказанной для конкретных условий эксперимента, с использованием рестриктаз, выбираемых из заранее сформированного списка. Программа предоставляет информацию о фрагментах, подвергающихся гидролизу выбранной рестриктазой.

Разработан алгоритм интеграции рестриктазного картирования in silico и in vitro. Картирование продуктов АИМС, получаемых в эксперименте, проводится, как и в случае компьютерного моделирования, на основе полной репрезентации АИМС. Для создания полной репрезентации in vitro из лабораторного протокола АИМС исключается этап гидролиза ДНК метилчувствительной рестриктазой SmaI. Таким образом моделируется состояние полного метилирования изучаемого генома. Пример полной репрезентации АИМС с удлинителем ССG и картирования трех из представленных на ней продуктов АИМС приведен на рис. 6.


 Пример рестриктазного картирования репрезентации АИМС in-4



Рис. 6. Пример рестриктазного картирования репрезентации АИМС in vitro (использована рестриктаза BssHII). Ось абсцисс – длины фрагментов ДНК в нуклеотидах, ось ординат – интенсивность сигналов флуоресценции. Красный график – электрофореграмма интактной полной репрезентации АИМС-ССG. Черный график – электрофореграмма полной репрезентации АИМС-ССG после гидролиза. Указана геномная принадлежность детектированных участков.



Валидация технологии AFLOAT: анализ дифференциального метилирования ДНК клеточных линий рака молочной железы

Демонстрацию возможностей технологии AFLOAT проводили на модели сравнения участков геномов клеточных линий РМЖ: ZR-75-1, HBL-100, HS578T, BT-474, T-47D и MCF7. Для создания репрезентаций эпигеномов использовался протокол АИМС с удлинителем ССG. Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС проводили в пределах длин от 150 до 200 п.н. При сравнении электрофореграмм выявлены дифференциально метилированные локусы в диапазонах длин 150-167, 167-176 и 176-190 п.н. (рис.7).

 Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС с-5








Рис. 7. Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС с удлинителем CCG для клеточных линий РМЖ. (В соавторстве с А.С.Танасом).

Моделирование с помощью программы AIMS in silico предсказывает получение в эксперименте АИМС с удлинителем CCG в указанном диапазоне трех групп продуктов: 1) ccg164, ccg165, ccg168; 2) ccg176, ccg177.1, ccg177.2, и 3) ccg189. С помощью программы AIMS in silico разработан и реализован план рестриктазного картирования этих локусов. В качестве примера приведем локус ccg165, для которого in silico предсказана уникальная картирующая рестриктаза SbfI. Гидролиз полной репрезентации АИМС этим ферментом позволил определить положение на электрофореграмме сигналов продуктов, соответствующих искомому локусу. Эти сигналы наблюдаются на уровне длин 160 и 162 п.н.; кроме того, на электрофореграмме виден один из продуктов гидролиза – 115 п.н. (рис. 8).

 Сравнение электрофореграмм полной репрезентации продуктов-6



Рис. 8. Сравнение электрофореграмм полной репрезентации продуктов АИМС (черным) и после гидролиза SbfI (красным). Зелеными стрелками обозначены пики продуктов, соответствующие продукту АИМС ccg165, синей стрелкой – продукт гидролиза.

В результате серии экспериментов однозначно определено положение на электрофореграмме пиков продуктов АИМС с удлинителем CCG, соответствующих локусам, дифференциально метилированным в исследуемых клеточных линиях, и охарактеризована геномную принадлежность этих локусов. Четыре из них представляют собой участки промоторных CpG-островков генов ATMIN, ANK3, MAFK и C2CD2, распространяющихся на первые экзоны и первые интроны генов. Два локуса являются межгенными CpG-островками, расположенными на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1. Седьмой локус не принадлежит CpG-островку и соответствует первому экзону гена PURB.

Результаты анализа метилирования, полученные методом AFLOAT, подтверждали метилспецифическим секвенированием исследуемых локусов (рис. 9).

 Пример валидации результатов AFLOAT методом метилспецифического-7


Рис. 9. Пример валидации результатов AFLOAT методом метилспецифического секвенирования. Фрагменты электрофореграмм секвенирования локуса ccg177.2 в клеточной линии MCF7. Стрелками указаны сайты узнавания рестриктазы SmaI в полностью метилированном состоянии (после бисульфитной обработки – TTCGGG).

Сравнение результатов, полученных методами AFLOAT и метилспецифического секвенирования, показало совпадение оценок статуса метилирования в 92% (33/36) случаев. В 3 случаях из 36 метилспецифическое секвенирование не подтвердило наличия метилирования, выявленного AFLOAT. Возможно, данные метилспецифического секвенирования в некоторых случаях не подтверждают метилированного статуса по причине недостаточной чувствительности собственно метода секвенирования. Опубликованные в литературе оценки различных методов выявления мутаций в отношении их способности определять мозаичные мутации показало следующие значения чувствительности (детектируемая доля молекул ДНК с мутацей в пуле ДНК дикого типа): секвенирование по Сэнгеру - 15-50%, анализ полиморфизма конформации однонитевых фрагментов / анализ гетеродуплексов - 5-25%, денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография - 5-25% и параллельное секвенирование - 1%. Использования только секвенирования по Сэнгеру недостаточно для выявления мозаичных мутаций низкого уровня. Параллельное секвенирование при достаточном количестве прочтений (глубине покрытия) позволяет достичь наилучших результатов, однако возможности его использования на сегодняшний день ограничены сложностью, высокой стоимостью анализа и доступностью оборудования.

В настоящем исследовании в качестве дополнительного метода подтверждения результатов AFLOAT применен метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов, показавший их аномальную электрофоретическую подвижность, говорящую о наличии метилированных клонов в спорных образцах. Проведенное исследование говорит о высокой чувствительности разработанного метода анализа дифференциального метилирования геномов.





Выявление и характеристика

дифференциально и константно метилированных локусов

в образцах рака молочной железы

Применение технологии AFLOAT к выборке операционных образцов РМЖ и нормальных тканей позволило идентифицировать 19 новых локусов генома, аномально метилированных при РМЖ. Совокупно с результатами применения МЧФП, в работе выявлено 26 таких локусов (табл. 2). Среди них 4 являются межгенными (области хромосом 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1), 5 – интронными (гены BIN1, RAI1, GPC2, PPP2R5C, PHF1), 2 расположены в первых экзонах (гены ATMIN, IQSEC2). Лишь около половины полученных фрагментов (относятся к генам LAMB1, KCNH8, DOCK6, SH3KBP1, C2CD2, KIAA1324L, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, KCNH2, CACNG4 и PSMF1) имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе. Таким образом, разработанные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции.

Сравнение электрофореграмм полных репрезентаций и продуктов АИМС для образцов ДНК нормальной молочной железы, РМЖ, РП, РМП и мононуклеаров периферической крови выявило среди продуктов АИМС с удлинителями GCG и CCG четыре константно метилированных фрагмента (рис. 10). Картирование показало, что эти фрагменты соответствуют интронному СpG-островку гена TAF4, участку интрона гена MAD1L1, CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного 3’-концевого экзона, и 3'-CpG-островку гена ZBTB4.

 Пример выявления константно метилированных локусов генома-8

Рис. 10. Пример выявления константно метилированных локусов генома путем сравнения электрофореграмм полной репрезентации (синяя линия) и продуктов АИМС (красная линия) с удлинителем СCG для образца ДНК нормальной молочной железы. Сигналы константно метилированных локусов указаны стрелками.

Таким образом, разработана оригинальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов злокачественных новообразований, в основе которой лежат способы получения фингерпринт-подобных репрезентаций по протоколам гидролиза ДНК метилчувствительными рестриктазами с последующей амплификацией (методы МЧФП и АИМС). Использование разработанных технологий для скрининга дифференциального метилирования геномов клеточных линий РМЖ и операционных образцов РМЖ позволило выявить 26 участков генома, подверженных аномальному метилированию, значительная часть из которых характеризуется неканонической локализацией, что подтверждает высокую эффективность методов и непредвзятость проведенного скрининга.

Особенности метилирования участков генома, выявленных скринингом дифференциального метилирования, проанализированы локус-специфическими методами анализа метилирования ДНК.

3.2. Локус-специфический анализ дифференциального метилирования геномов

Методология анализа метилирования отдельных геномных локусов

Методы анализа локус-специфических паттернов метилирования в большинстве своем требуют осуществления первоначальной амплификации исследуемой последовательности. Поскольку ДНК-полимераза в ходе синтеза ДНК не различает цитозин и 5-метилцитозин, в процессе полимеразной цепной реакции и клонирования информация о метилировании утрачивается. Ряд ферментов и химических соединений, таких как, метилчувствительные рестриктазы, бисульфит (HSO3-), гидразин (N2H4), перманганат (MnO4-), могут быть использованы для модификации оснований, что позволяет различить цитозин и 5-метилцитозин в ходе последующего анализа.

Для детекции продуктов расщепления ДНК метилчувствительными рестриктазами использован метод метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Праймеры для проведения МЧ-ПЦР фланкируют сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции, поэтому исследуемый фрагмент амплифицируется только при отсутствии расщепления ДНК по этому сайту. Для предупреждения ложноположительных результатов, возникающих из-за неполного гидролиза матрицы, необходимо предпринимать ряд предосторожностей. Поскольку доступность ДНК для рестрикции обычно уменьшается вследствие наличия примесей, наилучшим способом обеспечения полноты гидролиза является тщательная очистка ДНК с применением протеиназы К (Singer-Sam J. et al., 1990a). Следует учитывать и вероятность получения ложноотрицательных результатов, когда продукт МЧ-ПЦР с гидролизованной матрицы отсутствует не по причине полного гидролиза неметилированной ДНК образца, а по причине его плохого качества (деградация ДНК, ингибиторы ПЦР). Очевидно, адекватную техническую диагностику ложноположительных и ложноотрицательных результатов МЧ-ПЦР можно обеспечить лишь включением в систему двух типов контролей: эффективности ПЦР и полноты гидролиза матрицы.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 9 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.