WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Анализ дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга

-- [ Страница 4 ] --

Гидролиз продуктов АИМС эндонуклеазами рестрикции и сравнение электрофореграмм позволили однозначно определить положение пиков продуктов на электрофореграммах (рис. 11).

 Пример позиционирования пиков продуктов на электрофореграмме-10

Рис. 5. Пример позиционирования пиков продуктов на электрофореграмме продуктов АИМС клеточной линии MCF7 до (черным) и после гидролиза BssHII (красным). Зеленой стрелкой обозначен пик продукта, соответствующий ccg177.2, синей стрелкой – продукт гидролиза.

С использованием метода метилспецифического секвенирования (рис. 12) построены карты метилирования (рис. 13) выявленных локусов дифференциального метилирования.

 Пример электрофореграммы метилспецифического секвенирования локуса-11

Рис. 6. Пример электрофореграммы метилспецифического секвенирования локуса ccg177.2 в клеточной линии MCF7. Стрелками указаны сайты узнавания рестриктазы SmaI в полностью метилированном состоянии (после бисульфитной обработки – TTCGGG).

 Карты метилирования локуса генома человека, содержащего фрагмент-12

Рис. 7. Карты метилирования локуса генома человека, содержащего фрагмент АИМС ccg177.2. Белыми кружками показаны неметилированные CpG-динуклеотиды, черными – метилированные, серыми – частично метилированные, желтыми – CpG-динуклеотиды, состояние метилирования которых определить не удалось.

Сравнение результатов, полученных методами АИМС и метилчувствительного секвенирования, показало совпадение оценок статуса метилирования сайтов SmaI по всем исследуемым локусам во всех образцах, кроме локуса ccg164 (PURB) в линии HBL и локусов ccg168 и ccg177.1 в линии T47D, для которых метилспецифическое секвенирование не подтвердило наличия метилирования. Возможно, наблюдаемые расхождения объясняются более высокой чувствительностью метода АИМС по сравнению с секвенированием по Сэнгеру.

Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС клеточной линии HBL100 (рис. 14) показало, что уровень сигнала продукта АИМС, соответствующего локусу ccg168, примерно вдвое ниже, чем на электрофореграмме полной репрезентации, что согласуется с данными карты метилирования по локусу ccg168 для клеточной линии HBL100 – один сайт SmaI полностью метилирован, второй в полуметилированном состоянии (рис. 15). Уровень сигнала продукта АИМС, соответствующего локусу ccg164, значительно ниже, чем на электрофореграмме полной репрезентации, что позволяет предположить наличие в образце минорной субпопуляции геномов (мозаичность), в которых соответствующие CpG-динуклеотиды находятся в метилированном состоянии.

 Сравнение электрофореграмм полной репрезентации (черным) и продуктов-13

Рис. 8. Сравнение электрофореграмм полной репрезентации (черным) и продуктов АИМС (красным) клеточной линии HBL-100.

 Карты метилирования локуса генома человека, содержащего фрагмент-14

Рис. 9. Карты метилирования локуса генома человека, содержащего фрагмент АИМС ccg168 (ANK3). Здесь и далее белыми кружками показаны неметилированные CpG-динуклеотиды, черными – метилированные, серыми – в полуметилированном состоянии, желтым – CpG-динуклеотиды, состояние метилирования которых определить не удалось.

Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС клеточной линии T47D (рис. 16) показывает, что уровень сигналов продуктов АИМС, соответствующих локусам ccg168 и ccg177.1 значительно ниже, чем на электрофореграмме полной репрезентации, что может быть объяснено тем же явлением.

 Сравнение электрофореграмм полной репрезентации (черным) и-15

Рис. 10. Сравнение электрофореграмм полной репрезентации (черным) и продуктов АИМС (красным) клеточной линии T47D.

Метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов АИМС ccg168 показал в образце клеточной линии HBL100 наличие метилированных молекул, обладающих измененной электрофоретической подвижностью относительно неметилированной ДНК (

рис. 17). Для образца клеточной линии T47D показано наличие только фракций молекул с измененной электрофоретической подвижностью, в то время как результаты метилспецифического секвенирования (рис. 15) не показывают наличия метилирования ни по одному CpG-динуклеотиду, что может быть объяснено высокой гетерогенностью клеточной линии по статусу метилирования в связи с повреждением механизма поддержания метилирования в этой клеточной линии (Ting A.H. et al., 2006).

 Метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов по-17


Рис. 11. Метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов по локусу АИМС ccg168. 1, 3, 4, 5, 7 – образцы неметилированной ДНК. 2 – образец ДНК клеточной линии HBL100. 6 – образец ДНК клеточной линии T47D. Стрелками указаны сигналы, соответствующие неметилированным молекулам.

Проведенное исследование говорит о высокой чувствительности разработанного метода анализа дифференциального метилирования геномов. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR751, HBL100, HS 578 T, BT474, MCF7 и T47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования: участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.



ВЫВОДЫ.

  1. Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации интерметилированных сайтов) и высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного электрофореза - с математическим моделированием экспериментов позволило разработать современный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов.
  2. Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного математического моделирования, исключает необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов амплификации интерметилированных сайтов в процессе определения их геномной принадлежности.
  3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов амплификации интерметилированных сайтов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека.
  4. Проведенная характеристика иерархии продуктов амплификации интерметилированных сайтов и полученные описания количественных и качественных параметров репрезентаций для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование экспериментов.
  5. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR-75-1, HBL-100, HS 578 T, BT-474, MCF7 и T-47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

  1. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Современный высокотехнологичный метод скрининга дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов // Молекулярная медицина, 2009. № 4. С. 1826
  2. Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., Бабенко О.В., Кузнецова Е.Б., Землякова В.В., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Шкарупо В.В., Танас А.С. Маркеры метилирования в диагностике онкологических заболеваний // Медицинская генетика, 2010. Т.9 №1. С. 1521
  3. Танас А.С., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Дизайн эксперимента и анализ результатов амплификации интерметилированных сайтов с использованием компьютерной программы AIMS in silico // Молекулярная биология, 2010. Т.44 № 2. С. 355365
  4. Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Novel tools for unbiased DNA differential methylation screening // Epigenomics, 2010. Vol. 2. No. 2. P. 325333

Публикации в других изданиях:

  1. Танас А.С., Стрельников В.В., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Современный высокотехнологичный метод диагностики маркеров метилирования в онкологии // Онкогематология, 2008. №4. С. 7374
  2. Strelnikov V.V., Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova E.B., Zaletaev D.V. Unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigenetic research. 11 European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumours // Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, 2008. P. 5960
  3. Shkarupo V.V., Tanas A.S., Kuznetsova E.B., Zavalishina L.E., Frank G.A., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. A semi-automated unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigenetic research // Eur. J. Hum. Genet., 2008. V.16. Suppl. 2. P. 223
  4. Шкарупо В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В.,Залетаев Д.В. Метод анализа структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Москва, 2008. С. 489
  5. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Синтетический непредвзятый метод скрининга дифференциального метилирования геномов опухолевых клеток // V Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», научная программа и тезисы, 2008.





    С. 9495

  6. Танас А.С., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Программное обеспечение для скринига дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов // Медицинская генетика, 2009. Т.8. №12 (90). С. 33
  7. Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova E.B., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Amplification of intermethylated sites, Bioinformatics and Capillary electrophoresis: the ABC of the cancer methylomes // Eur. J. Hum. Genet., 2009. V.17. Suppl.2. P. 284
  8. Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Software for Genomic/Epigenomic Research // Eposters.net – the online journal of scientific posters, 2009. EP10983
  9. Шкарупо В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // Медицинская генетика, 2009. Т.8. №12 (90). С. 41
  10. Стрельников В.В., Танас А.С., Землякова В.В., Залетаев Д.В. Разработка новых методов диагностики маркеров метилирования ДНК в онкологии // Учебник под ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева "Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических новообразований". М.: ОАО «Идательство «Медицина», 2009. 384 с.: ил. (Учеб. лит. для студ. мед. вузов). ISBN 5-225-03384-9. УДК 606-006.04.07:575. Глава 11. С. 349384
  11. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Современные высокотехнологичные методы диагностики маркеров метилирования ДНК в онкологии // Пятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009. С. 9091
  12. Шкарупо В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Скрининг дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г.Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 197
  13. Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Шкарупо В.В., Танас А.С., Залетаев Д.В. Уроки непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г.Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 172173
  14. Strelnikov V., Tanas A., Shkarupo V., Kuznetsova E., Gorban N., Zaletaev D. Non-microarray DNA differential methylation screening in breast cancer // 12th European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumors, Nijmegen, the Netherlands, 3-6 June 2010. P. 104
  15. Tanas A., Shkarupo V., Kuznetsova E., Zaletaev D., Strelnikov V. AIMS in silico & PeakPick: a software package supporting unbiased screening of DNA differential methylation in cancer // 12th European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumors, Nijmegen, the Netherlands, 3-6 June 2010. P. 106
  16. Танас А.С., Шкарупо В.В., Стрельников В.В. Компьютерная программа AIMS in silico // Рекламно-техническое описание, описание программы, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050017. Москва, 2010 г.
  17. Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В. Компьютерная программа PeakPick // Рекламно-техническое описание, описание программы, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050040. Москва, 2010 г.
  18. Руденко В.В., Танас А.С., к.б.н. Стрельников В.В., к.б.н. Кузнецова Е.Б., проф. Залетаев Д.В. Скрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса // Медицинская ДНК-технология, Разрешение ФС № 2011/132 от 27.05.2011г.
  19. Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Алгоритмы и программное обеспечение скрининга эпигенетических нарушений при раке // Шестой московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2011. С. 139140
  20. Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Танас А.С. Методы анализа метилирования ДНК // Учебник под ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева «Введение в молекулярную диагностику», том 2 «Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний». М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2011. – 506 с.: ил. (Учеб. лит. для студ. мед. вузов). С. 8099
  21. Танас А.С., Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Алгоритмы и программное обеспечение скрининга дифференциального метилирования геномов клеток злокачественных новообразований // III Международная Студенческая Научно-практическая Конференция РУДН, 2011. С. 2526
  22. Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Танас А.С., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Скрининга дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // III Международная Студенческая Научно-практическая Конференция РУДН, 2011. С. 2425
  23. Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В. Программа для ЭВМ "AIMS in silico 2". Рекламно-техническое описание, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201151514, Москва, 2011 г.

Список сокращений.

АИМС - амплификация интерметилированных сайтов

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

КЭФ – капиллярный электрофорез

п.н. – пара нуклеотидов

ПААГ – полиакриламидный гель

ПЦР – полимеразная цепная реакция

РМЖ – рак молочной железы

т.п.н. – тысяча пар нуклеотидов



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.