WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Молекулярно – генетическое исследование наследственной предрасположенности к раку желудка

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи





Цуканов Алексей Сергеевич

Молекулярно генетическое исследование наследственной предрасположенности

к раку желудка

03.00.15 – «Генетика»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2008

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Карпухин Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Мякоткин Валерий Андреевич

доктор медицинских наук, профессор

Акуленко Лариса Вениаминовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный

медицинский университет Федерального

агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится « » 2008 г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001.016.01,

доктор медицинских наук Зинченко Р. А.

Актуальность темы.

Рак желудка (РЖ) относится к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин в России рак этой локализации занимает 3-е место и 2-е место у мужчин. Ежегодно в нашей стране заболевает 46 тысяч человек, а одногодичная летальность составляет 56% [Давыдов М.И., 2004].

Около 5-10% случаев рака желудка имеет семейную историю. Молекулярной причиной предрасположенности к раку желудка с высоким риском (70-83%) являются наследуемые мутации в ряде генов. К основным из них относятся гены CDH1, MLH1 и MSH2. Специфическим геном-супрессором семейного РЖ считают ген CDH1. Частота мутаций в этом гене варьирует от 0 до 10% от всех случаев семейного рака желудка в зависимости от этнической принадлежности изучаемой выборки. Вероятность обнаружения мутации может быть повышена при использовании определенных критериев отбора семей [Brooks-Wilson A.R. et al., 2004].

Примерно у 10-20% семей с РЖ встречаются случаи рака толстой кишки [Oliveira C. et al., 2003]. Семьи с раком желудка могут соответствовать критериям синдрома наследственного неполипозного рака толстой кишки. Данное заболевание, как правило, связано с наследуемыми мутациями в генах MLH1 и MSH2. Мутации в этих генах обнаруживают в семьях с РЖ и с раком толстой кишки, не отвечающих критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки, а также в семьях с РЖ без случаев рака толстой кишки [Kim J.C. et al., 2001].

Частоты мутаций в генах предрасположенности к раку желудка различны в выборках из разных популяций мира. В России указанные гены при семейном раке желудка ранее не были исследованы. Восполнение этого пробела позволит внести существенный вклад в изучение особенностей мутационных процессов в разных популяциях. Кроме того, число исследований ряда генов предрасположенности на одной и той же выборке семейного рака желудка в настоящее время не велико. Проведение такого исследования позволит оценить вклад разных генов в семейную предрасположенность к раку желудка, значение чего усиливает существование популяционных особенностей.

Мутации даже в нескольких известных генах в совокупности объясняют только часть случаев семейного РЖ. Поиски дополнительных генов предрасположенности к РЖ до настоящего времени не дали результатов. В связи с этим внимание исследователей обращается на изучение вариантов генов предрасположенности по однонуклеотидным полиморфизмам, которые могут выступать в качестве аллелей риска. В пользу этого говорят данные о функциональном значении некоторых из них, в частности, в гене CDH1. Такие варианты могут быть ассоциированы и с риском спорадического РЖ.

Определение характеристик вариаций в генах, связанных с возникновением рака желудка важно не только с фундаментальной точки зрения, но и для решения практических медико-генетических задач. Основной причиной высокой смертности больных раком желудка является позднее выявление болезни. Следовательно, вопросы своевременной диагностики и профилактики рака желудка весьма актуальны, так как запоздалая клиническая диагностика во многих случаях этого онкологического заболевания обусловливает существенное сокращение продолжительности жизни, несмотря на лечение.

Изучение молекулярно-генетических причин предрасположенности к раку желудка создаст новые возможности для медико-генетического консультирования и профилактики заболевания.

Цель исследования.

Изучение молекулярно-генетических особенностей предрасположенности к раку желудка, основанное на анализе изменений первичной структуры генов CDH1, MLH1, MSH2.

Задачи исследования:

1. Изучение мутаций в генах CDH1, MLH1 и MSH2 при семейном раке желудка.

2. Изучение однонуклеотидных полиморфизмов в гене CDH1 при семейном и



спорадическом раке желудка и в контрольной выборке.

3. Анализ гаплотипов в гене CDH1 по однонуклеотидным полиморфизмам и

микросателлитным маркерам.

Научная новизна исследования. Впервые изучены характеристики вариантов в генах CDH1, MLH1, MSH2 на выборке семейного рака желудка в России. Мутации в генах MLH1 и MSH2 обнаружены как в семьях с только раком желудка, так и включающих наряду с раком желудка рак толстой кишки. При этом наибольшую частоту мутаций наблюдали в семьях с присутствием рака толстой кишки наряду с раком желудка. Показана ассоциация с раком желудка генотипов -160AA и 2076TT в гене CDH1. Обнаружено синергическое влияние на риск развития рака желудка генотипов по вариантам -160С/A и 2076C/T в гене CDH1. Выявлено, что генотип 2076ТT связан с риском развития рака желудка в присутствии генотипа -160CA и не приводит к повышению такого риска в присутствии генотипа -160CС. С помощью гаплотипирования по микросателлитным маркерам показано отсутствие единого гаплотипа при вариантах риска по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1, что свидетельствует в пользу влияния на риск развития именно данных вариантов.

Практическая значимость работы. Практическая значимость результатов настоящей работы обусловлена выявлением связи вариантов первичной структуры ДНК генов CDH1, MLH1 и MSH2 с возникновением семейного и спорадического рака желудка. Выявленные мутаций в генах MLH1 и MSH2 при семейном раке желудка, в том числе их высокая частота с присутствием в семье случая рака толстой кишки, имеют существенное значение для практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку желудка. Обнаруженная ассоциация с раком желудка генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1 может служить основой для последующей разработки протокола диагностики повышенного риска развития рака желудка.

Внедрение в практику. Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в работу ГУ МГНЦ РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При впервые проведенном исследовании особенностей первичной структуры генов CDH1, MLH1 и MSH2 среди российских пробандов с семейным раком желудка у 13% из них выявлены мутации в генах MLH1 и MSH2, что указывает на значение этих генов в возникновении наследственной формы рака желудка.

2. Функционально значимый вариант -160A/A в промоторном участке гена CDH1 ассоциирован с заболеванием раком желудка как у больных семейной формой рака желудка, так и при спорадических случаях. Генотип 2076ТT связан с риском развития рака желудка в присутствии генотипа -160CA и не приводит к повышению риска в присутствии генотипа -160CС.

3. Гаплотипирование по трем микросателлитным маркерам показало, что варианты 2076T и -160A в гене CDH1 не находятся в составе какого-либо единого протяженного гаплотипа на одной хромосоме, что свидетельствует в пользу самостоятельного значения этих вариантов.

Личное участие автора в получении научных результатов. Основная часть исследований: выделение ДНК, молекулярно-генетическая диагностика - полимеразная цепная реакция; рестрикционный анализ; метод SSCP; гетеродуплексный анализ; детекция в полиакриламидных гелях; изучение обнаруженных вариантов in silico; гаплотипирование при помощи микросателлитных маркеров; статистическая обработка результатов выполнена автором самостоятельно.

Апробация работы. Основные результаты доложены на V Съезде Российского общества медицинских генетиков 2005, на Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы, 2006» и на конференциях European Human Genetics Conference 2007 и European Human Genetics Conference 2008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных публикаций, из них 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список литературы (96 источников, из них 90 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 22 таблицами.

Материалы и методы исследования

Сбор образцов крови пациентов, в основном из Москвы и Московской области, и анализ родословных семей пробандов осуществляли в Российском Онкологическом Научном Центре РАМН им. Блохина с участием к.м.н. Л.Н. Любченко, к.м.н. М.П. Никулина, проф., д.м.н. Р.Ф. Гарькавцевой.

Критерием отбора при семейном раке желудка служило наличие у пробанда одного или более родственников I/II степени родства, страдающего таким же заболеванием. Среднее число больных членов семьи (I и II степени родства) в выборке составило 3 человека. В выборку входили также пробанды с РЖ, в семьях которых были случаи рака толстой кишки. Пробандов, как с семейным анамнезом, так и со спорадическим РЖ отбирали в выборку по мере их поступления в Онкологический Научный Центр при подтверждении наличия первичного данного заболевания у пробанда и выяснения семейной истории.

В результате работы проведено молекулярно-генетическое исследование ДНК 241 человека (129 пациентов и 112 человек контрольной группы). Были исследованы 30 пробандов с семейным РЖ и 99 пробандов со спорадическим РЖ. Среди пробандов с семейным РЖ 8 пациентов имели диффузную форму РЖ, 22 человека – интестинальную форму.





Контрольную группу составили здоровые люди, в семьях которых не было случаев РЖ и рака толстой кишки. Возраст участников контрольной выборки соответствовал диапазону возрастов пробандов с диагнозом РЖ.

ДНК из лимфоцитов периферической крови выделяли с использованием инкубации в среде, содержащей протеиназу К и SDS (0,5%, инкубация 3 часа при 55°С), с последующей экстракцией фенолом и хлороформом.

Методом полимеразной цепной реакции с использованием 16 пар праймеров амплифицировали все 16 экзонов гена CDH1 с примыкающими частями интронов (50 – 100 п. н.) [Berx G. et al, 1998]. Варианты первичной структуры амплифицированных фрагментов ДНК гена CDH1 выявляли методом SSCP. Электрофорез проводили в 6% полиакриламидном геле (трис-боратный буфер, pH=8,9).

Для амплификации всех экзонов гена MLH1 использовали 19 пар праймеров, гена MSH2 -16 пар праймеров [Kolodner R. et al., 1994, 1995]. Фрагменты генов BRCA1 и BRCA2 амплифицировали с помощью 88 пар праймеров. Электрофоретическое выявление особенностей первичной структуры фрагментов ДНК этих генов проводили с помощью метода CSGE [Поспехова Н.И. и др., 2005]. Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле (трис-глициновый буфер, pH=9).

Наличие возможных гаплотипов гена CDH1 было исследовано на основе анализа двух внутригенных полиморфных маркеров (каждый маркер представлен двумя аллелями) и 3 микросаттелитных повторов, изученных согласно базе данных http://gdb.org .

Для выяснения значения некоторых обнаруженных вариантов первичной структуры использовали программу предсказания сайтов сплайсинга NetGene2 ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2 ). Значения промоторных вариантов в генах CDH1 и MLH1 изучали с помощью программы Genomatix ( http://www.genomatix.de ).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием точного критерия Фишера. Для расчетов использовали программу Statistica 6.0. Доверительный интервал для значений отношения шансов (OR) рассчитывали согласно работе [Реброва О.Ю., 2003].

Результаты и их обсуждение

Исследование пробандов с семейным раком желудка на наличие мутаций в гене CDH1. Сформированная выборка больных семейным раком желудка соответствовала по структуре семейных форм этого заболевания наблюдаемым в других европейских популяциях [Oliveira C., 2003]. Она включала около 30% больных наследственным диффузным раком желудка. Пробанды с раком желудка, в чьих семьях встречали рак толстой кишки и/или рак молочной железы, составили примерно 20% выборки.

У 30 пробандов группы семейного РЖ изучали первичную структуру генов CDH1, MLH1 и MSH2, с которыми с наибольшей вероятностью связана наследственная форма РЖ.

При изучении первичной структуры ДНК гена CDH1 у пробандов группы семейного РЖ мутаций в гене CDH1 обнаружено не было, но было выявлено 3 редких однонуклеотидных варианта: 1896С>T в 12 экзоне; 2253C>T в 14 экзоне и 531+10G>C в 4 интроне (рис.1,2).

 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 экзон 14 экзон -0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

12 экзон 14 экзон

Рис. 1. Электрофоретическое разделение методом SSCP амплифицированных фрагментов ДНК гена CDH1. 3 лунка – 1896С/T; 5 лунка – 2253C/T; лунки 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 – норма.

G/C

 Сиквенс фрагмента последовательности ДНК в районе полиморфизма NT-1

Рис. 2. Сиквенс фрагмента последовательности ДНК в районе полиморфизма

NT 531+10G>C. Стрелкой указана замена нуклеотида G на С.

Поскольку в литературе существует подразделение РЖ по гистологическим типам и семейной истории, выборка была проанализирована с этой точки зрения. С учетом существующей классификации было выделено 3 группы: 1) больные наследственным диффузным раком желудка; 2) больные семейным интестинальным раком желудка; 3) больные раком желудка, в чьих семьях встречались рак толстой кишки и/или рак молочной железы.

Для выделения первой из указанных групп семей использовали критерии наследственного диффузного рака желудка, определенные Международным Консорциумом по Раку Желудка (IGCLC) [Caldas С. et al., 1999] с последующими дополнениями согласно работе [Brooks-Wilson A.R. et al., 2004]. Всего было выявлено восемь семей, отвечающих критериям наследственного диффузного рака желудка. Характеристика пробандов и их семей представлена в табл.1. Критерию 1а - два или более случаев рака желудка в семье, при этом один из них диффузный и диагностирован в возрасте до 50 лет - удовлетворяет 75% семей (табл. 1). Двое больных не имели родственников с РЖ, однако соответствовали критерию 3 - индивидуальный случай диффузного рака желудка, диагностированный в возрасте до 35 лет.

В данной группе был найден редкий вариант 2253C>T, не приводящий к замене аминокислоты.

В группе из 16 больных семейным интестинальным раком желудка в семье в среднем встречали около 3-х больных раком желудка. Раки другой локализации в этих семьях отсутствовали. В этой группе больных редких вариантов в гене CDH1 не обнаружено.

Третья группа больных характеризовалась присутствием в семье, помимо РЖ, также рака толстой кишки и/или рака молочной железы. В семьях 4 пробандов кроме РЖ встречался только рак толстой кишки, в одной семье – только рак молочной железы и еще одна семья имела как рак толстой кишки, так и рак молочной железы (табл. 2).

Таблица 1. Характеристика семей с перстневидно-клеточным (диффузным) раком желудка у пробанда и варианты в гене CDH1



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.