WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Молекулярно-генетическая характеристика болезней дыхательной цепи митохондрий у детей.

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЦЫГАНКОВА

Полина Георгиевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЕЗНЕЙ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ У ДЕТЕЙ.

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук


Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Захарова Екатерина Юрьевна


Официальные оппоненты:

Мальмберг Сергей Александрович, доктор медицинских наук, профессор,

Центральная детская клиническая больница Федерального медико-биологического агентства России, заведующий отделением психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями


Стрельников Владимир Викторович, кандидат биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эпигенетики


Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии" Минздравсоцразвития России, научно-исследовательский отдел врожденных и наследственных заболеваний с поражением центральной нервной системы и нарушением психики

Защита состоится «19» ноября 2012 г. в 12 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.


Автореферат разослан «______» октября 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских

и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Болезни дыхательной цепи митохондрий (БДЦМ) – гетерогенная группа заболеваний, относящаяся к классу наследственных болезней обмена веществ (НБО). БДЦМ характеризуются нарушением электронтранспортной цепи митохондрий и снижением уровня окислительного фосфорилирования. Вследствие этих процессов уменьшается продукция АТФ – основного источника клеточной энергии, что приводит к гибели клеток и повреждению различных тканей и органов. Полипептиды комплексов дыхательной цепи митохондрий (КДЦМ) кодируются как митохондриальной ДНК (мтДНК), так и ядерными генами (Rotig A., Munnich A., 2003).

В группу БДЦМ входят более 30 различных нозологических форм, при этом наибольшее их число дебютирует в раннем детском возрасте (Wallace D.C, Fan W, Procaccio V., 2010), приводит к тяжелым мультисистемным заболеваниям с преимущественным поражением нервной системы. Распространенность самой частой детской формы БДЦМ, синдрома Ли, оценивается как 1:40000 живых новорожденных (Rahman S., et al., 1996). А по данным нескольких независимых исследований суммарная частота этой группы заболеваний составляет ~ 1:5000 живых новорожденных (Chinnery P.F. et al., 2000; Schaefer A.M. et al., 2008). Лечение митохондиальных заболеваний в данное время симптоматическое (Stacpoole P.W., 2011).

Диагностика митохондриальных болезней осложняется большим числом ядерных генов, мутации в которых могут приводить к БДЦМ, наличием большого числа фенокопий среди других наследственных заболеваний, а также отсутствием однозначных диагностических лабораторных критериев (Suomalainen A., 2011). Несмотря на большую ценность анализа последовательности мтДНК и ядерных генов митохондриальных заболеваний, накопленных на сегодняшний день данных об особенностях спектра и частотах мутаций при младенческих и детских формах БДЦМ не достаточно для формирования эффективных диагностических алгоритмов.

Предполагается, что более глубокое и масштабное исследование первичного молекулярно-генетического дефекта с использованием новых высокотехнологичных методов молекулярной генетики позволит переломить эту ситуацию (Koene S., Smeitink J., 2011).

Изучение ядерных генов, вовлеченных в обеспечение работы дыхательной цепи митохондрий, началось сравнительно недавно и на сегодняшний день открыто более 100 генов, ответственных за БДЦМ (Smeitink J., et al., 1999; DiMauro S., et al., 2001; Hinttala R., et al., 2005; Horvath R., et al., 2006; Kollberg G., et al., 2009; Naess K., et al., 2009; Spinazzola A., et al., 2009). Характеристика спектра мутаций в этих генах, изучение их роли в формировании разных клинических форм заболеваний является одним из важных направлений исследований и, в перспективе, создает базу для разработки методов эффективного лечения этих заболеваний (Chiaratti M.R., et al., 2011; Saada A., 2011).



Разработка быстрых и точных методов молекулярной диагностики митохондриальных болезней также даст возможность врачам вовремя назначить специфическую метаболическую терапию, которая в некоторых случаях приводит к стабилизации состояния пациента или, иногда, даже значительному его улучшению (Enns G.M., et al., 2012).

С практической точки зрения установление первичного молекулярно-генетичского дефекта позволяет точно определить тип наследования и в ряде случаев прогноз по заболеванию.

Цель работы.

Целью данного исследования является молекулярно-генетическая характеристика частых форм БДЦМ у детей и разработка алгоритмов дифференциальной диагностики данной группы заболеваний.

Задачи исследования.

  1. Сформировать выборку пациентов с БДЦМ, манифестирующих в раннем детском возрасте.
  2. Охарактеризовать спектр и частоту мутаций в основных ядерных генах (SURF1, POLG) и митохондриальной ДНК при разных формах БДЦМ.
  3. Оценить вклад мутаций мтДНК в развитие синдрома Ли.
  4. Создать алгоритм лабораторной диагностики основных форм БДЦМ у детей.

Научная новизна.

Впервые для российских больных с детскими формами БДЦМ проведено молекулярно-генетическое исследование митохондриальной ДНК и ядерных генов, позволившее выявить первичный молекулярно-генетический дефект у 34% пациентов из 4 клинических групп (синдром Ли, болезнь Альперса, митохондриальный гепатоцеребральный синдром, синдром Пирсона). На репрезентативной выборке из 50 пациентов выявлены клинические особенности синдрома Ли, обусловленного мутациями гена SURF1. Охарактеризован спектр мутаций в гене SURF1 при синдроме Ли у российских пациентов, установлена высокая частота мутации c.845_846delCT по сравнению со странами Западной Европы. Впервые проведен анализ всей последовательности митохондриальной ДНК пациентов с синдромом Ли, что позволило оценить вклад мутаций митохондриального генома в развитие данной патологии. В результате работы обнаружено 3 мутации мтДНК, ранее не описанные в литературе, изучено их семейное накопление. Впервые в практике отечественной медицины был установлен молекулярно-генетический дефект при болезни Альперса и охарактеризован спектр мутаций в гене POLG, ответственном за развитие данной патологии. Показана высокая частота двух мутаций p.W748S, p.A467T в гене POLG у пациентов с разными клиническими формами митохондриальных гепатопатий. У 4 пациентов с редкими клиническими формами БДЦМ выявлены мутации в генах MPV17, DGUOK, PDHA1, NDUFV1, ранее не изучавшихся отечественными исследователями.

Теоретическая и практическая значимость.

Описание в работе множества вновь выявленных мутаций в генах, ответственных за работу дыхательной цепи митохондрий, вносит вклад в изучение разнообразия первичных генетических дефектов, связанных с нарушением биоэнергетических процессов в клетке и приводящих к митохондриальным болезням. На основании полученных данных о спектре и частоте мутаций в митохондриальной ДНК и ядерных генах митохондриальных заболеваний разработаны простые ДНК-тесты, позволяющие в кратчайшие сроки провести детекцию наиболее частых мутаций при младенческих и детских БДЦМ. Разработанные лабораторные методики могут применяться во всех молекулярно-диагностических лабораториях, специализированных на наследственных болезнях.

Установленные клинические особенности отдельных нозологических форм БЦДМ позволяют сформировать критерии, по которым возможно сузить дифференцильно-диагностический поиск. Разработанный алгоритм лабораторной диагностики БДЦМ у детей, основанный на последовательном анализе генов, существенно уменьшает сроки подтверждения диагноза и создает основу для медико-генетической помощи семьям с больными детьми.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Распределение пациентов с подозрением на болезни дыхательной цепи митохондрий, манифестирующие в раннем детском возрасте, в одну из 4 клинических групп (синдром Ли, болезнь Альперса, митохондриальный гепатоцеребральный синдром, синдром Пирсона) на основе клинических и биохимических данных является эффективным приемом для начального этапа диагностики данной группы заболеваний.
  2. Самое частое митохондриальное заболевание у детей - синдром Ли - является генетически гетерогенным, В выборке российских больных представлены варианты с аутосомно-рецессивным (при мутациях в генах SURF1, NDUFV1), Х-сцепленным (при мутациях в гене PDHA1) и материнским (мутации митохондриальной ДНК) наследованием.
  3. В 27% случаев при синдроме Ли наблюдаются нарушения в гене SURF1, 59% мутантных аллелей приходится на долю мажорной мутации - c.845_846delCT. На долю мутаций митохондриальной ДНК при синдроме Ли приходится 7%. Самой частой мутацией митохондриальной ДНК является мутация m.T8993G/C в районе ATP6 (38% случаев).
  4. При митохондриальных гепатопатиях (болезни Альперса и митохондриальном гепатоцеребральном синдроме) выявлены мутации генов, вовлеченных в репликацию митохондриальной ДНК (POLG, DGUOK, MPV17). Мутации p.W748S, p.A467T в гене POLG составляют 42% мутантных аллелей.
  5. Разработанные тесты на частые мутации и алгоритм лабораторной диагностики данной группы заболеваний позволили выявить первичный генетический дефект у 34% обследованных больных.





Апробация работы.

Материалы исследования доложены на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005, 2011 годах; ежегодных конференциях международного общества по изучению наследственных болезней обмена веществ в 2007, 2008, 2010, 2011 годах; на научно-практическом семинаре «Молекулярно-генетические методы в генетике человека» в 2006 году (Минск); на Всероссийском съезде неврологов в 2006 году (Ярославль); на международных конференциях по митохондриальной физиологии в 2010 и 2011 годах; на международной конференции по митохондриальной патологии в 2011 году (Сарагоса); на конференциях молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН в 2009, 2011 годах (диплом и премия в 2011году); на Российских конгрессах с международным участием

«Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное» в 2010 и 2012 годах (Санкт-Петербург); на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 году.

Личный вклад автора.

Автором лично проводились все этапы молекулярно-генетического анализа, а именно выделение геномной ДНК, дизайн праймеров для анализа генов методом секвенирования и дизайн праймеров для MLPA-анализа, подбор условий и проведение полимеразных цепных реакций для всех изучаемых ядерных генов и митохондриальной ДНК. Автор собственноручно проводил ПДРФ-анализ, а также секвенирование на генетическом анализаторе ABI3500.

Вместе с врачами автор принимал активное участие в составлении таблиц с клиническими критериями диагностики болезней дыхательной цепи митохондрий у детей. Рекомендации по проведению молекулярных исследований, оформленные в диагностическую схему, составлены автором самостоятельно. Соискатель провел анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликовано 21 печатная работа, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 1 глава в национальном руководстве, 16 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 42 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 144 ссылки, и 3 приложения.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал для исследования.

Молекулярно-генетические исследования проведены в группе из 250 пациентов с ранними детскими формами БДЦМ, направленных в лабораторию наследственных болезней обмена веществ с 2005 по 2011 года. Также ДНК-анализ был проведен всем доступным членам семьи по материнской линии пациентов с мутациями мтДНК (всего 19 человек). Определение носительства мутаций в ядерных генах БДЦМ у родителей пациентов проведено в 52 случаях.

Анализ клинических данных проведен для 64 пациентов: 49 пациентов с синдромом Ли, 10 пациентов с болезнью Альперса и 4 пациентов с митохондриальным гепатоцеребральным синдромом. Возраст манифестации заболевания у пациентов не превышал 4 лет. Возраст манифестации был выбран, как критерий для включения пациентов в настоящее исследование. Данное ограничение сделано для исключения из исследования таких патологий, как синдромы KSS, MELAS, MERRF, молекулярные основы которых уже были изучены ранее, в том числе отечественными авторами. Соотношение полов в группе из 250 пациентов – 131 мужского пола: 119 женского пола.

ДНК была выделена из цельной венозной крови или пятен высушенной капиллярной крови наборами “DNA Prep200” («IsoGene», Россия) по протоколу изготовителя. Полимеразную цепную реакцию, рестрикционный анализ, мультиплексную амплификацию на основе лигазных проб, анализ конформации однонитевой ДНК и электрофорез проводили стандартными методами (Sambrook J. et al., 1989, Schouten J.P., et al., 2002). Для анализа частых мутаций митохондриальной ДНК использованы эндонуклеазы рестрикции BglI, AsuC2I, BsuRI, MboI, BstPAI, BsuRI, TaqI («СибЭнзим», Россия). Секвенирование экзонов ядерных генов и кодирующей последовательности митохондриальной ДНК проведено по протоколам производителя на приборах ABI Prism 3100 и ABI Prism 3500 («Applied Biosystem», США) в лаборатории ДНК-диагностики и лаборатории наследственных болезней обмена веществ Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Так как в России до настоящего времени не проводилось исследований по диагностике БДЦМ у детей, по литературным данным разработаны критерии, позволяющие на основании клинических данных и результатов биохимического исследования отнести больных в одну из четырех клинических групп: «синдром Ли» (СЛ); «болезнь Альперса» (БА), митохондриальный гепатоцеребральный синдром (МГС); «синдром Пирсона» (СП). Критерии представлены в таблице 1. Включение пациентов в ту или иную группу исследования проводилось на основании особенностей поражения нервной системы в сочетании с поражениями других систем органов. Большую часть выборки составили больные с СЛ (n=182, 72%). Из них пациентов с классическим фенотипом СЛ – 144 (80%); с Ли-подобным заболеванием 38 (20%) (имеют более позднюю манифестацию, атипичную картину на МРТ головного мозга и медленно прогрессирующее течение). Также в исследование включено 55 пациентов (22%) с митохондриальной энцефалопатией и поражением печени (44 пациентов с БА и 11 пациентов с МГС) и 13 пациентов (5%) с синдромом Пирсона.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.