WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Изучение особенностей положения хромосом 6, 12, 18 и x в ядрах мезенхимных стволовых клеток в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Вольдгорн

Яна Иосифовна

Изучение особенностей положения хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах мезенхимных стволовых клеток в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования

03.02.07-генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Лавров Александр Вячеславович

Официальные оппоненты:

Рубцов Михаил Александрович кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», биологический факультет МГУ, кафедра молекулярной биологии, старший научный сотрудник

Ревазова Юлия Анатольевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, отдел гигиены, токсикологии пестицидов и химической безопасности, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «17» декабря 2012 г. в ____ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите диссертаций на соискание ученой

степени кандидата наук, на соискание

ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Проблема хромосомных территорий широко обсуждается в современной научной литературе. Под “хромосомной территорией” (ХТ) понимается та часть ядра, в которой с помощью гибридизации меченой ДНК и трехмерной микроскопии выявляется хромосомный материал (Рубцов Н.Б., 2007). Многочисленные исследования показывают, что расположение ХТ в интерфазном ядре не случайно. Позиционирование ХТ связано с такими процессами, как дифференцировка и старение клеток (Cremer M. et al, 2001). В ряде случаев удается установить взаимосвязь между изменениями в положении ХТ и развитием заболевания (Kozubek S. et al, 1999; Kuroda M. et al, 2004; Mewborn S. et al, 2010; Taslerova R. et al, 2003).

Особый интерес представляет изучение ХТ в малодифференцированных клетках, в частности, в мезенхимных стволовых клетках (МСК). МСК способны дифференцироваться в мезенхимные и не мезенхимные клетки, повышают репаративный потенциал и обладают иммуносупрессивной активностью. Важными преимуществами МСК перед прочими стволовыми клетками являются легкость получения и культивирования. В совокупности свойства МСК обеспечили широкое их использование в регенеративной медицине, в области клеточной терапии и тканевой инженерии. При этом необходимость в большинстве случаев культивирования МСК in vitro поднимает вопросы безопасности таких трансплантатов. При оценке биобезопасности МСК важно среди прочих параметров оценивать возможные изменения строения ядер, как ранние проявления процессов фундаментальных изменений в функционировании клеток. Кроме того, МСК являются удобным объектом изучения такого эпигенетического фактора, как ХТ, т.к. МСК легко подвергаются направленной дифференцировке in vitro. Это позволяет детально изучать изменения положения ХТ и их роль, как во взрослых стволовых клетках, так и в процессах дифференцировки стволовых клеток в различные терминально дифференцированные специализированные клетки.

Настоящая работа посвящена изучению позиционирования отдельных хромосом в интерфазных ядрах МСК до и после длительного культивирования, а так же до и после дифференцировок в остеогенном и адипогенном направлениях.

Цель исследования

Выявить различия в положении хромосом 6, 12, 18, X в интерфазных ядрах МСК в зависимости от направления дифференцировки и сроков культивирования как индикаторы пространственной реорганизации ядра.

Задачи исследования

  1. Сформировать выборки препаратов МСК на ранних и поздних пассажах и после дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлениях.
  2. Провести FISH-анализ ядер МСК на ранних и поздних пассажах с применением центромерных зондов к хромосомам 6, 12, 18, X.
  3. Провести FISH-анализ ядер МСК, дифференцированных в адипогенном и остеогенном направлениях с применением центромерных зондов к хромосомам 6, 12, 18, X.
  4. Определить кариологические характеристики положений центромер изучаемых хромосом в полученных ядрах клеток МСК.
  5. Сравнить кариологические характеристики положений центромер изучаемых хромосом в МСК на ранних и поздних пассажах, а так же до и после дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлениях.

Научная новизна



Впервые получены данные, характеризующие положение центромер хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах МСК. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер хромосом 6, 12, 18 и X до и после длительного культивирования, выявлены различия в положениях центромер хромосом 6 и X. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер хромосом 6, 12, 18 и X до и после дифференцировки в остеогенном направлении, выявлены различия в положении центромеры хромосомы X. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромер хромосом 6, 12, 18 и X до и после дифференцировки в адипогенном направлении, выявлены различия в положении центромер хромосом 12 и 18. Впервые для МСК проведено сравнение положения центромеры хромосомы X в мужских клетках с положениями центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы X в женских клетках, показано промежуточное положение центромеры хромосомы X в мужских клетках относительно положения центромер проксимального и дистального гомологов хромосомы X в женских клетках.

Практическая значимость

Данные об архитектуре интерфазного ядра МСК позволяют лучше понять особенности этого вида стволовых клеток, имеющих большой терапевтический потенциал. Получены новые данные об изменениях, наблюдающихся в позиционировании отдельных хромосом в ядрах МСК после длительного культивирования и после их дифференцировки. Данный вопрос представляет особую важность, так как связан с проблемой биобезопасности МСК и возможности медицинского применения данной культуры после длительного культивирования. Также полученные результаты могут быть использованы в дальнейших фундаментальных исследованиях роли пространственной организации интерфазного ядра в клеточной биологии.

Положения, выносимые на защиту

  1. Центромеры хромосом 6, 12, 18 и X в ядрах МСК занимают различные специфичные для них положения.
  2. Длительное культивирование, а так же дифференцировка в остеогенном и адипогенном направлениях приводит к изменению положения изученных хромосом 6, 12, 18 и Х.
  3. Специфичность значений кариологических параметров для разных клеток свидетельствует о важном значении пространственной организации хроматина для функционирования клетки.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010г), на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-наДону, 2010), на Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011г), на XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секция “Биология” (Москва, 2012), на European Human Genetics Conference (Nuremberg, 2012) и на рабочих семинарах в ФГБУ “МГНЦ” РАМН, лаборатория мутагенеза (Москва, 2010-2012 гг).

Личный вклад автора в проведении исследования. Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Большая часть экспериментальных исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации и 5 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 28 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 ссылок.

Материалы и методы

Получение и культивирование клеток

МСК из жировой ткани любезно предоставлены Лабораторией стволовой клетки ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Москва). Клеточные культуры готовились по стандартной методике подготовки клеток для трансплантации в клинических целях.

Адипогенная дифференцировка клеток

МСК культивировали до конфлюэнтности 60-70%, после чего в среду добавляли 100мкМ индометацина, 1мкМ дексаметазона, 0,5мкМ 1-метил-3-изобутилксантина и 10мкг/мл инсулина и культивировали 20 дней. Среду меняли каждые 3-4 дня. После культивирования клетки зафиксированы в метаноле и для подтверждения дифференцировки окрашены красителем Oil Red O (3мг/мл Oil Red O в 60 % растворе изопропанола) в течение 15 минут. Данная методика обеспечивает дифференцировку не менее 90% клеток в адипогенном направлении, что подтверждено оценкой числа клеток, содержащих жировые включения.





Остеогенная дифференцировка клеток

МСК культивировали до конфлюэнтности 60-70%, после чего в среду добавляли 50мкМ L-аскорбиновой кислоты фосфата, 10мМ бета-глицерофосфата и 100нМ дексаметазона и культивировали 17 дней. Среду меняли каждые 3-4 дня. После культивирования клетки фиксированы в метаноле и для подтверждения дифференцировки окрашены красителем Alizarin Red (2% Alizarin Red в 0,1M NH4OH; pH=5,4) в течение 15 минут. Данная методика обеспечивает дифференцировку не менее 85% клеток в остеогенном направлении, что подтверждено оценкой числа клеток, претерпевших характерные морфологические изменения.

Приготовления цитогенетических препаратов

После удаления среды клетки промывали фосфатным буфером (ФБ) и выдерживали в ледяном 100% метаноле в течение 8 минут, промывали ФБ и дистиллированной водой. Проводили дегидратацию последовательно в этиловом спирте 70%, 85% и 96%, по три минуты в каждом. Высушивали препараты на воздухе.

FISH-анализ

Для проведения интерфазного FISH-анализа использовали зонды фирмы «Vysis, Inc.» CEP6 (D6Z1), CEP12 (D12Z3), СЕР18 (D18Z1), СЕРХ (DXZ1) альфа-сателлитной ДНК для хромосом 6; 12; 18; Х. Подготовку и гибридизацию препаратов проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Для контрастной окраски ядер использовали краситель DAPI.

Определение кариологических характеристик ядра

Положение центромер определяли при помощи специально разработанной программы, с помощью которой вычисляли центр ядра и безразмерную величину радиальное расстояние центромеры r по формуле r=r1/R, где r1 – расстояние от центра ядра до центра сигнала, R – радиус ядра, проходящий через центр сигнала. Ядра МСК являются уплощенными эллипсоидами с относительно малым вертикальным размером ядра. Поэтому ядра рассматривали как плоские объекты. В плоских ядрах размеры сигналов зондов часто сопоставимы с толщиной ядра (Croft J., 1999), что затрудняет адекватное распознавание центра сигнала при трехмерном FISH-анализе. В ряде статей показано, что распределение гибридизационных сигналов на плоских препаратах адекватно отражает положение хромосомных территорий в относительно плоских и длинных ядрах фибробластоподобных клеток. (Boyle S., 2001; Croft J., 1999; Csink and Henikoff, 1998). Кроме того, показано отсутствие существенных изменений в трехмерном строении ядер после фиксации в ПФА (Cremer et al., 1993; Kurz et al., 1996). Размеры и форма ядер МСК сопоставимы с ядрами фибробластов и сохраняют особенности своей трехмерной структуры как после фиксации ПФА, так и после фиксации метанолом (размеры ядра фибробласта после фиксации ПФА приблизительно 15x25x6 мкм (Croft J., 1999), размеры ядра МСК после фиксации ПФА 12x20x8 мкм, размеры ядра МСК после фиксации метанолом МСК 10x15x8 мкм). В связи с вышеперечисленными данными, в данной работе использовалась двумерная микроскопия.

Для анализа внутриядерной локализации выбрали хромосому 18, как одну из наиболее хорошо изученных в подобных исследованиях – бедную генами хромосому, расположенную обычно на периферии ядра; хромосомы 6 и 12, как несущие ряд генов, связанных с недифференцированным статусом стволовых клеток или их дифференцировкой в выбранном направлении (гены, BMP6, HDAC2, RUNX2, OCT4 и NANOG, STELLA и GDF3, соответственно), а так же хромосому X, поскольку один из гомологов этой хромосомы (тельце Барра) заведомо неактивен в ядрах женских культур клеток. Определение различий в положении двух гомологов Х-хромосомы может являться в определенной мере контролем правильности избранного метода оценки положения хромосом в ядре. Также интерес представляет определение положения хромосомы Х в мужских клетках. Анализировали положение центромер указанных хромосом. Подобный способ анализа широко известен по литературным данным и хорошо себя зарекомендовал в различных исследованиях положения хромосом в нормальных и аберрантных клетках (Vorsanova S., 2010)

Статистический анализ данных

Статистический анализ проводили с помощью программы STATISTICA 6.0.

Определены медианы и средние для последующего сравнения полученных данных с данными литературы. Распределения радиальных расстояний в изученных культурах отклонялись от нормальных распределений (проверка соответствия нормальности по критериям Лиллиефорса и Колмогорова-Смирнова), что не позволяет в полной мере описать характер распределения радиальных расстояний одним параметром. Поэтому распределение радиальных расстояний центромер анализировали с помощью сравнения числа сигналов, находящихся в пяти интервалах радиальных расстояний: 0-0,2, 02,-0,4, 0,4-0,6, 0,6-0,8, 0,8-1. Значимость результатов подтверждена путем статистического анализа с использованием непараметрических методов (Хи-тест, критерии Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса и дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса), значимыми считались результаты при р<0,05.

Результаты и обсуждение



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.