WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Значение определения числа копий генов локуса 5q13 в диагностике проксимальных спинальных мышечных атрофий i-iv типа

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Забненкова Виктория Владимировна

Значение определения числа копий генов локуса 5q13 в диагностике проксимальных спинальных мышечных атрофий I-IV типа

03.02.07 “Генетика”

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА-2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении  «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Дадали Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

Иллариошкин Сергей Николаевич, доктор медицинских наук, профессор.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр неврологии» Российской академии медицинских наук, заместитель директора по научной работе.

Куцев Сергей Иванович, доктор медицинских наук, доцент.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой морфологии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «_19_»__марта__ 2012г. в _____ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан «___»___________ 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,доктор медицинских наук,

профессор Зинченко Рена Абульфазовна

Актуальность темы

Проксимальная спинальная мышечная атрофия (СМА) – одно из наиболее тяжелых нейромышечных заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования. Клинические проявления заболевания характеризуются прогрессирующими симптомами вялого паралича вследствие дегенерации -мотонейронов передних рогов спинного мозга. Выделяют четыре клинических типа заболевания на основе различий в возрасте начала, тяжести течения и продолжительности жизни. Эти типы СМА являются аллельными генетическими вариантами, развитие которых обусловлено мутациями в гене SMN. Ген картирован на хромосоме 5 в локусе 5q12.2-q13.3 и имеет центромерную (SMNc) и теломерную копии (SMNt). К возникновению проксимальных СМА приводят мутации в теломерной копии гена SMNt, который состоит из девяти экзонов (1, 2a, 2b, 3-8) и кодирует белок выживаемости мотонейронов (survival motor neuron). Основным типом мутаций в этом гене являются делеции экзонов 7 и/или 8, которые выявлены у 95% больных. Остальные 5% больных являются компаунд-гетерозиготами по делеции в одной копии гена SMNt и точковой мутации в другой.

Обнаружение делеции экзонов 7 и/или 8 в гомозиготном состоянии позволяет подтвердить диагноз СМА у больного. Показано, что оба гена SMN расположены в области инвертированного повтора, в котором локализовано, по крайней мере, ещё три гена – NAIP, SERF1A (H4F5), GTF2H2, также представленные теломерной и центромерной копиями. Исследования, проведенные рядом авторов, показали, что различия в возрасте манифестации и тяжести течения аллельных вариантов проксимальных СМА I-IV типов могут быть обусловлены модифицирующим влиянием как числа копий гена SMNc, так и других генов этого региона - NAIP, SERF1A (H4F5), GTF2H2. Установлено, что у больных со СМА II-III типов число копий гена SMNc больше, чем у лиц с I типом заболевания. Показано, что приблизительно у 80% людей в популяции в целом наблюдается 1-2 копии гена SMNc, а у 5-10% здоровых людей обнаруживается отсутствие гена SMNc. У пациентов со СМА разнообразие числа копий гена SMNc гораздо больше и может варьировать от 1 до 6 копий. Таким образом, изучение количества центромерных и теломерных копий генов SMN может быть полезным для прогнозирования тяжести течения заболевания. Кроме того, при проведении медико-генетического консультирования возникает проблема повторного расчета риска рождения больного ребенка в отягощенной семье или в новом браке родителей пробанда с проксимальной СМА. Это требует уточнения генетического статуса консультирующихся, направленного на выявление носительства ими мутации в гене SMN в гетерозиготном состоянии. Учитывая значительную частоту заболевания, проведение анализа носительства мутаций в этом гене показано для вновь созданных супружеских пар. Принимая во внимание, что показатели частоты заболевания в различных популяциях варьируют от 1:6000 до 1:10 000 новорожденных, можно рассчитать, что гетерозиготным носителем мутации в гене SMN является каждый 40-50 человек.



Однако традиционная молекулярная диагностика проксимальной спинальной мышечной атрофии представляет собой качественную детекцию делеции экзонов 7 и/или 8 гена SMNt, которая не дает возможность выявлять всех носителей мажорной мутации в гене SMNt в гетерозиготном состоянии. Это связано с тем, что при использовании полуколичественного метода определяется не число копий генов на геном, а соотношение числа центромерных и теломерных копий гена SMN. Отклонение данного соотношения от единицы может быть обусловлено как снижением числа копий гена SMNt, так и увеличением числа копий гена SMNc. Ограничения, возникающие при использовании качественных методов детекции гетерозиготного носительства мутаций в гене SMNt, могут создать значительные трудности при проведении медико-генетического консультирования отягощенных семей. Отсутствие уверенности в существовании гетерозиготного носительства не позволяет:

- подтвердить диагноз СМА у умершего ребенка, биологический материал которого не доступен, рассчитать риск рождения больного ребенка в семье и провести дородовую диагностику;

- точно определить статус носительства мутации в гене SMNt у партнера облигатного носителя при вступлении им в новый брак;

- сформировать группу больных со СМА, имеющих делецию в гетерозиготном состоянии для поиска точковых мутаций в другой копии гена.

Эти проблемы могут быть решены при разработке методов количественного анализа числа копий генов SMNt и SMNc, использование которых позволит прогнозировать тяжесть течения СМА, оптимизировать процесс определения гетерозиготного носительства, а также проводить тестирование донорских половых клеток при проведении ЭКО. Значительная распространенность СМА обуславливает необходимость проведения скрининга доноров спермы и яйцеклеток, и в случае выявления носительства, исключать его из данной программы.

Цель исследования


В соответствии со всем выше изложенным поставлена следующая цель работы: решение проблемы анализа гетерозиготного носительства гена проксимальной спинальной мышечной атрофии путем совершенствования молекулярно-генетических методов диагностики СМА и оценка частоты носительства гена у чувашей, удмуртов и жителей московского региона.

Задачи исследования


  1. Разработка системы количественного анализа генов локуса 5q13 на основе специфической лигазной реакции.
  2. Оценка влияния числа копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD17 на тяжесть клинических проявлений и течение заболевания в выборке российских больных.
  3. Выявление взаимосвязи между числом копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD17 и тяжестью течения двух клинических вариантов СМА I типа и двух клинических вариантов СМА III типа.
  4. Определение частоты носителей делеций в гене SMNt в гетерозиготном состоянии и дупликаций гена SMNc у чувашей, удмуртов и жителей московского региона.

Научная новизна

Впервые в России разработана новая количественная методика анализа генов локуса 5q13, ответственных за развитие проксимальной СМА I-IV типов, на основе мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией, позволяющая определять абсолютное число копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2 и RAD17.

Впервые проведена оценка частоты гетерозиготного носительства делеций в гене SMNt и установлена частота дупликаций гена SMNc у чувашей, удмуртов и жителей московского региона с помощью количественного анализа генов локуса 5q13.

Впервые проведен анализ влияния числа копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD17 на тяжесть клинических проявлений проксимальной СМА у российских больных.

Выявлена взаимосвязь между числом копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD17 и тяжестью течения двух клинических вариантов СМА I типа в выборке российских больных.

Практическая значимость

Разработанный количественный метод оценки числа копий генов локуса 5q13, ответственных за развитие проксимальной спинальной мышечной атрофии I-IV типов, повышает точность диагностики гетерозиготного носительства гена проксимальной СМА. Использование этого метода сделает более эффективным медико-генетическое консультирование семей, в которых недоступен материал больного ребенка или вновь созданных супружеских пар, в которых один из супругов является облигатным гетерозиготным носителем гена проксимальной СМА.

Новая методика может быть использована, для скрининга гетерозиготного носительства гена проксимальной СМА у доноров, участвующих в программе ЭКО, а также для оценки популяционной частоты носительства гена проксимальной СМА.

Положения, выносимые на защиту

  1. Разработана эффективная методика количественного анализа генов локуса 5q13 (SMNt, SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD17) на основе мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией.
  2. Показано влияние числа копий гена SMNc на тяжесть течения проксимальной СМА. У большинства пациентов со СМА I типа обнаружено две копии гена SMNc, в то время как у больных СМА II-III типа чаще встречается 3-4 копии этого гена. Выявлено наличие взаимосвязи между числом копий гена SMNc и тяжестью течения заболевания внутри одной клинической формы СМА I типа.
  3. Обнаружено влияние делеции гена NAIP на тяжесть течения СМА. Показано, что ген NAIP делетирован у 36,4% больных СМА I типа. Число копий генов GTF2H2 и RAD17 не оказывает влияния на тяжесть клинических проявлений и течение заболевания.
  4. Частота носительства делеций в гене SMNt в гетерозиготном состоянии составляет 1 на 37 человек у чувашей и 1 на 36 человек у удмуртов и жителей московского региона. Частота дупликаций гена SMNc у чувашей, удмуртов и жителей московского региона составляет 1,5%, 4% и 2,5%, соответственно.

Апробация работы





Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010, на конференциях European Human Genetics Conference 2010, 2011.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, сформирована группа обследования. Автор лично выполнил всю экспериментальную работу. Автор провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 6 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы по определению числа копий генов локуса 5q13 в диагностике проксимальных спинальных мышечных атрофий I-IV типа внедрены в практику медико-генетического консультирования при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "МГНЦ" РАМН).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Библиография содержит 100 источников, из них 8 отечественных и 92 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 13 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили образцы ДНК выделенной из крови пробандов.

Для анализа частоты носительства гена проксимальной СМА I-IV отобраны образцы здоровых ДНК людей, принимавших участие в эпидемиологическом исследовании лаборатории генетической эпидемиологии ФГБУ "МГНЦ" РАМН, а так же образцы ДНК из банка лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ "МГНЦ" РАМН и ФГБУ " НИИ медицинской генетики " СО РАМН (г. Томск).

Исследованы образцы ДНК 260 здоровых чувашей из неродственных семей, образцы ДНК 253 здоровых удмуртов из неродственных семей. При формировании выборки учитывалась этническая принадлежность, т.е. все лица, принимавшие участие в исследовании, являются коренными чувашами и удмуртами, соответственно.

Исследованы образцы ДНК 285 здоровых жителей Москвы и Московской области из неродственных семей.

Для оценки влияния числа копий генов локуса 5q13 на тяжесть течения проксимальной СМА I-IV отобраны образцы ДНК пациентов научно-консультативного отдела ФГБУ "МГНЦ" РАМН и медико-генетической консультации г. Воронежа.

Исследованы образцы ДНК 201 пациента из неродственных семей с диагнозом СМА I-III типов. Больные СМА I типа составили n=77 человек. Больные СМА II типа составили n=58 человек. Больные СМА III типа составили n=65 человек. СМА IV типа представлена одним больным. Пациенты отобраны на основе критериев Европейского консорциума по изучению нервно-мышечных заболеваний. Кроме этого, диагноз у всех пациентов подтвержден молекулярно-генетическим методом с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа. Все пациенты СМА имеют делецию экзонов 7-8 гена SMNt в гомозиготном состоянии.

Контрольная выборка взята из банка ДНК лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ "МГНЦ" РАМН. Ее составил 141 необследованный неродственный человек.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполнено с помощью набора реактивов для выделения Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) по протоколу производителя.

Амплификация всех исследуемых фрагментов ДНК проведена методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия)

Определение числа копий генов SMNt, SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD17 осуществлено методом мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией (MLPA). Математическую обработку результатов количественной ПЦР проводили с помощью программы CoffalyserV8, представленной в свободном доступе на сайте MRC-Holland ( http://mlpa.com ).

Статистическая обработка проведена с использованием программы Statistica 7.0. При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью критерия 2 и его сравнения с табличными данными. Уровень значимости p<0,05 принят достаточным для признания различий достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ числа копий генов SMN на плазмидных моделях

Для определения числа копий генов SMN создана система, в основе которой лежит мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA), впервые предложенная в 2002 году компанией MRC-Holland. Подробности метода и последовательности праймеров представлены в разделе «Материалы и методы».

Разработка осуществлена в два этапа.

Задачей первого этапа стало тестирование новой методики на соблюдение количественности при анализе числа копий генов SMN.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.