WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Атомно-силовая микроскопия аффинных взаимодействий в микробиологиии

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи­

Краевский

Сергей Владимирович

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

В МИКРОБИОЛОГИИИ

03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оболенск 2011

Работа выполнена в ФГУП «Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики».

Научные руководители: кандидат биологических наук

Игнатюк Т. Е.

кандидат биологических наук

Игнатов С. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Жариков Г. А.

доктор биологических наук

Герасимов В. Н.

Ведущая организация: Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита диссертации состоится «30» июня 2011 года 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «___» _____________ 2011 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по адресу:

142279, Оболенск Серпуховского района Московской области, ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, ученому секретарю совета

Н.К. Фурсовой. Факс 8(4967) 36-00-10, e-mail: fursova@obolensk.org

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Свойство аффинности определяет способность молекул к химическому взаимодействию между собой и играет большую роль в микробиологии при изучении взаимодействий антиген-антитело или фаг-бактерия. Методы сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), в том числе атомно-силовой микроскопии (АСМ), появившиеся в 1980-х годах, уже прочно вошли в арсенал физических методов, использующихся при изучении различных микробиологических объектов. Создание биочипов, разработка новых способов секвенирования ДНК, создание биологических контейнеров для доставки лекарств в организм – вот далеко не полный перечень актуальных на сегодняшний день вопросов, для решения которых можно использовать АСМ. Изучение поведения биополимеров и биополимерных комплексов, в том числе антиген-антитело, на поверхности подложки и особенностей их адсорбции востребовано для создания биосенсоров, для развития молекулярной электроники, для дизайна молекулярных архитектур.

Актуальность исследования такого взаимодействия как «фаг-клетка» сложно переоценить. Бактериофаги традиционно используются для передачи генетической информации в генетической инженерии, кроме того, всё более распространяющаяся резистентность бактерий к антибиотикам делает задачу развития фаготерапии более чем актуальной.

Широкий спектр возможностей, предоставляемый зондовой микроскопией для изучения бактерий и фагов - от получения трехмерных изображений с атомным разрешением до исследования локальных свойств объекта - обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.

Целью диссертационной работы является применение атомно-силовой микроскопии для исследования аффинных взаимодействий фаг-бактерия и антиген-антитело в микробиологии.

Задачи исследования:

  1. Разработать метод визуализации и исследования взаимодействия «фаг-клетка» с помощью атомно-силовой микроскопии;
  2. Исследовать различные стадии процесса инфицирования фагом бактериальной клетки с помощью АСМ;
  3. Исследовать различные комбинации высокомолекулярных неспецифических модификаторов для улучшения сорбционных свойств поверхности по отношению к бактериальным клеткам для дальнейшего атомно-силового сканирования;
  4. Разработать методику создания поверхности из активных антител, оптимизировать параметры такой методики с помощью атомно-силовой микроскопии, количественно и качественно исследовать сорбционные свойства полученной поверхности.

Научная новизна работы:

Разработана новая методика создания аффинной поверхности из активных антител для специфической визуализации бактерий. Проведены количественные и качественные АСМ исследования сорбционных свойств высокоспецифичной поверхности по отношению к фрагментам бактериальных клеток. Впервые разработан подход для изучения специфического взаимодействия фаг-клетка с помощью АСМ и проанализированы различные стадии заражения бактериальной клетки фагом для трех различных видов бактерий. С помощью АСМ изучались другие модификаторы поверхности, которые увеличивают адсорбцию определённых клеток.

Научная и практическая значимость

Разработан метод специального приготовления образцов бактериальных культур для исследования с помощью АСМ, что позволяет использовать данный метод для изучения аффинных взаимодействий в микробиологии. Разработанный метод исследования взаимодействия фаг-бактерия позволяет в физиологических условиях проследить различные этапы данного процесса, а также описать свойства бактериофага, важные для характеристики препаратов бактериофагов, предлагаемых для фаготерапии. Разработанные в процессе работы аффинные подложки на основе антител позволяют идентифицировать не только клетки бактерий, но и нанофрагменты бактериальных клеток. Основные результаты диссертационной работы использованы в процессе выполнения работ лабораторией атомно-масштабных исследований конденсированных сред ФГУП «Институт теоретической и экспериментальной физики» по гранту МНТЦ №3245 «Бионанотехнологический анализ аффинных поверхностей».



Положения, выносимые на защиту

  1. Разработанный подход для изучения специфического взаимодействия бактериофаг-бактерия с помощью АСМ позволяет анализировать различные стадии заражения бактериальной клетки фагом.
  2. Модификаторы поверхности подложек (ЦТАБ-лектин, БСА-глутаровый альдегид, крахмал, агароза) значительно увеличивающих адсорбцию бактериальных клеток.
  3. Аффинные поверхности на основе антител обеспечивают специфическую визуализацию бактерий и их фрагментов с помощью АСМ.
  4. Математическая обработка параметров взаимодействия антиген-антитело, заложенная в методе АСМ-детектирования, позволяет дать количественные и качественные характеристики процесса визуализации.

Личный вклад соискателя

Все экспериментальные измерения с помощью зондовой микроскопии выполнены автором лично. Кроме того, автор принимал участие в приготовлении образцов бактериальных клеток, бактериофагов, белков и их комплексов - совместно с сотрудниками ФГУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» (Оболенск) и физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах: 8th International EMBL Symposium, Heidelberg, Germany, November 2006; Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств». Протвино, 2006; Первая Всероссийская Школа-семинар Современные достижения бионаноскопии. Москва, 2007; ESF-EMBO Symposium on Probing Interactions between Nanoparticles/Biomaterials and Biological Systems, Sant Feliu de Guixols, Spain, 2007; Тhe XV International Conference and discussion scientific club “New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology”. Yalta-Gurzuf, Ukraine, 31 May-9 June 2007; IV International conference on “NanoBio and related new and perspective biotechnologies”. Pushchino, 2007; V I Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика -2007», Москва, 2007; Вторая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, 2008; Международный форум по нанотехнологиям. Научно-технологических секция. Москва, 2008; Международная научно-практическая конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве». Москва, 2008; Первая Международная научная школа “Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах”. Москва, 2009; Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, 2009; Восьмая Курчатовская молодежная школа, Москва, 2010; Четвёртая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, 2010.

Диссертация апробирована на расширенном заседания секции НТС №4 (межлабораторном научном семинаре) ФГУП «Государственный научный центр РФ - Институт Теоретической и Экспериментальной Физики» от 18 марта 2011 г.

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 16 печатных работах, из них 5 статей в рецензируемых журналах из перечня ВАК и 11 публикаций в сборниках, трудах и материалах конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы, включающего 122 наименования: 4 ссылки на русском языке и 118 на английском. Работа изложена на 101 страницах, содержит 29 рисунков и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались штаммы грамотрицательных бактерий Escherichia coli 057 и Salmonella enteritidis 89 с их фагами, A157 и 39, соответственно, а также грамположительные бактерии Bacillus thuringiensis 393 с фагом Vf, предоставленные Государственным Исследовательским Центром Прикладной Микробиологии и Биотехнологий (Оболенск).

Приготовление образцов для сканирования на воздухе. На подложку наносили 10 - 20 мкл суспензии, или подложку помещали сверху на каплю или полностью погружали в раствор, содержащей исследуемый объект, выдерживали 1-15 минут для адсорбции, а затем высушивали в струе азота.

В качестве подложек использовали как свежесколотые, так и подвергнутые различным модификациям поверхности слюды, графита, кремния и золота. В качестве модификаторов использовали методику тлеющего заряда, а также такие соединения, как бычий сывороточный альбумин (БСА), лектин выделенный из Triticum vulgare, лектин выделенный из Canavalia ensiformis, глутаровый альдегид, Фиколл 400, имунноглобулин G и антитела.





АСМ-измерения проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope IIIa (Digital Instruments, USA) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,01, и 0,3 Н/м (в зависимости от объекта). Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 11,5 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 193 - 325 кГц.

Для обработки изображений использовали программу ФемтоСкан Онлайн (Центр перспективных технологий, Россия).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 содержит подробный обзор литературы по теме диссертации. Рассматриваются основы методов зондовой микроскопии (разделы 1.1-1.3), в особенности атомно-силовой, их преимущества и недостатки, по сравнению с методами электронной микроскопии, артефакты изображений, а также возможности при исследовании биологических объектов, таких как биополимеры, бактерии и бактериофаги. Описываются различные режимы работы АСМ. Особое внимание уделено рассмотрению сил, действующих между зондом и поверхностью во время сканирования. Разделы 1.4-1.6 содержат краткую справочную информацию по изучаемым биологическим объектам, а также обзор работ по конкретному применению АСМ (в основном) и СТМ для изучения схожих биологических объектов. Раздел 1.7 посвящен АСМ вирусов, бактериофагов, а также актуальным проблемам фаготерапии. Подчеркнута потребность в прямых in vivo экспериментах по визуализации взаимодействия бактериофага с клеткой. Перечислены как наиболее значимые достижения в этой области, так и те проблемы, которые до настоящего времени решить не удалось.

Глава 2 посвящена исследованию с помощью АСМ взаимодействия фаг – клетка. В разделе «материалы и методы» Главы 2 подробно описывается разработанная методика эксперимента на примере грамотрицательных бактерий Escherichia coli 057 и Salmonella enteritidis 89 с их фагами, A157 и 39, соответственно.

Рис. 1 Бактериофаги А157 к E. Coli: (a) АСМ изображения полученные в тейпинг режиме, (b) Трехмерный вид (размеры изображения примерно 600х600х60 нм2); (c) ПЭМ изображение; (d) Профиль сечения вдоль пунктирной линии с АСМ изображения; (e) гистограмма распределения по высотам головок бактериофагов.

Процедура приготовления образцов для нанесения на подложку была следующая: суспензии, содержащие клетки (их концентрация варьировалась от 109 до 1010 кл./мл) и бактериофаги (1010-1011 шт./мл) смешивали друг с другом, после чего помещали в термостат при температуре 37 0С. Затем пробы отбирали в различное время после инкубации и центрифугировали со скоростью 5000 об/с, чтобы избавиться от посторонних примесей и не связавшихся бактериофагов. Осадок суспензировали в дистиллированной воде. Полученную суспензию наносили на свежий скол слюды для дальнейшего АСМ исследования.

На рис. 1 представлены изображения бактериофага v18/A157 к Escherichia coli, полученные с помощью АСМ (а, б) и ПЭМ (в), сечение, демонстрирующее профиль двух частиц бактериофага (г) и гистограмма распределения высоты головок бактериофага (д). Как видно из АСМ- и ПЭМ-изображений, бактериофаг v18/A157 состоит из головки и отростка.

Другой используемый в нашей работе бактериофаг, бактериофаг 39/s.e. к Salmonella enteritidis, не обнаруживает отростка на АСМ- и ПЭМ-изображениях и имеет более размытое распределение высот головки с максимумами, приходящимися приблизительно на значения 25 и 33 нм. Тот факт, что для обоих бактериофагов значение высоты, полученное из АСМ-изображений, меньше диаметра головки, объясняется как эффектом «высыхания» на подложке, так и воздействием кантилевера на образец. АСМ исследования взаимодействия Escherichia coli с бактериофагами v18/A157 показали, что бактериофаги закрепляются на поверхность клетки, и по прошествии некоторого количества времени клеточная стенка разрушается. Причем бактериофаги обнаруживаются на поверхности клетки уже через 5 минут после их совместного термостатирования, затем количество бактериофагов заметно растет. АСМ-изображения клеток Escherichia coli, смешанных с бактериофагами 39/s.e. к Salmonella enteritidis при тех же условиях, не выявили наличия взаимодействия.

Такая же серия экспериментов была проведена нами и для клеток Salmonella enteritidis и бактериофагов к ним (39/s.e.). Соответствующие АСМ-изображения приведены на рисунке 2. Так же, как и в предыдущем случае, обнаружено связывания бактериофагов с клеточной стенкой бактерий и рост количества связанных бактериофагов с течением времени.

Отличительной особенностью было то, что бактериофаги были специфично связаны с кончиками пилей S. enteritidis. Термостатирование смеси клеток Salmonella enteritidis с бактериофагами v18/A157 к Escherichia coli в течение часа, не выявило наличия связывания.

В следующем эксперименте взаимодействие фаг – клетка рассмотрено на примере грам-положительных бактериальных клеток Bacillus thuringiensis, со специфичными к ним бактериофагами.

Исследуемые клетки имеют форму палочек, длина которых (3 - 8 мкм в зависимости от возраста) в несколько раз больше ширины (около 1 мкм), а высота (или диаметр) клеток на поверхности слюды составляет около 500 нм.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.