WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Разработка и применение диагностического биопрепарата yp – 09 угсха на основе бактериофагов yersinia pseudotuberculosis

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Катмакова Надежда Петровна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БИОПРЕПАРАТА «YP 09 УГСХА» НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ульяновск – 2010

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования

«Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич

доктор биологических наук, профессор

Золотухин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ежкова Галина Олеговна

доктор биологических наук, профессор

Красноперова Юлия Юрьевна

Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Защита диссертации состоится «3» декабря 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 44-30-58, e-mail: kormlen@yandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО

«Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Автореферат диссертации разослан «28» октября 2010 года и размещен на сайте: http://ugsha.ru/  

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, ученому секретарю диссертационного совета

Ученый секретарь

диссертационного совета Л.А. Пыхтина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекция, вызываемая Yersinia pseudotuberculosis, привлекает к себе внимание исследователей в связи с ростом заболеваемости и все более широким ее распространением (Г.П. Сомов, 1990; Г.В. Ющенко, 2000; H. Fukushima, 2001; В.Ф. Учайкин, 2008).

Несмотря на достигнутые успехи в изучении многих аспектов иерсиниозов, актуальность этой проблемы сохраняется. Стабильные показатели заболеваемости по РФ псевдотуберкулезом (данные официальной статистики) – 7,1 на 100 тыс. населения – в последние 5 лет не отражают истинного распространения инфекций (Г.Я. Ценева, 2006). Анализ изученных факторов патогенности подтверждает абсолютную патогенность бактерий вида Y. pseudotuberculosis для людей и животных (Г.Я. Ценева, 1984; Ю.Е. Полоцкий, 1987; Н.Ф. Тимченко, 1997; Н.Д. Ющук, 2003).

О выделении штаммов Y. pseudotuberculosis из отдельных регионов при эпидемических вспышках, групповых заболеваниях или спорадических случаях людей и животных сообщается в работах M. Tsubokura et al. (1989); Г.Г. Головиной (2000); С.Н. Бениовой (2000); М.В. Чесноковой (2003); K. Jalava et al. (2004); S. Kangas et al. (2008) и др.

В последние годы выражена тенденция к активному изучению и применению в лабораторно-диагностической практике фагов бактерий различных родов и видов (В.Я. Ганюшкин, 1988; С.Н. Золотухин, 1994; Н.Е. Гаевская, 2004; Л.Д. Македонова, 2006; Т.А. Кудрякова, 2010). Бактериофаги применяются для идентификации и фаготипирования бактерий, а также ускоренной индикации возбудителей бактериальных инфекций в различных субстратах. Все большую актуальность приобретают фаготерапия и фагопрофилактика инфекционных болезней как альтернатива использованию антибиотиков.

Многообразие клинических форм псевдотуберкулезной инфекции, высокая стоимость современных лабораторных методов, отсутствие квалифицированных кадров зачастую затрудняют постановку диагноза в рядовых лабораториях, в связи с чем поиск и разработка методов своевременной индикации возбудителя, вызывающего заболевание, являются актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Цель – разработка технологических параметров изготовления и применения биопрепарата «YP – 09 УГСХА» на основе выделенных специфических фагов для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis. Поставленная цель решалась следующими задачами:

  1. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Y.pseudotuberculosis.
  2. Изучить основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфологию негативных колоний, литическую активность, спектр литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость, чувствительность к воздействию хлороформа.
  3. Подобрать штаммы бактериофагов с заданными биологическими свойствами – высокой литической активностью, широким спектром литического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий, порогом инактивации – для конструирования диагностического биопрепарата.
  4. Разработать схему идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis с помощью специфических псевдотуберкулезных бактериофагов.
  5. Разработать схему ускоренной индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью диагностического биопрепарата на основе фагов YP – 2 УГСХА и YP – 7 УГСХА методом РНФ.
  6. Разработать биотехнологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «YP – 09 УГСХА» на основе выделенных и изученных бактериофагов Y. pseudotuberculosis.

Научная новизна. Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий вида Y. pseudotuberculosis, изучены их основные биологические свойства. Разработаны параметры схемы индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью выделенных и изученных бактериофагов. Впервые разработана технология изготовления диагностического биопрепарата на основе специфических псевдотуберкулезных фагов.



Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные псевдотуберкулезные бактериофаги, пригодные для изготовления диагностического биопрепарата с целью индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды. Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии индикаторных псевдотуберкулезных бактериофагов YP – 2 УГСХА, YP – 7 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с использованием диагностических бактериофагов YP – 2 УГСХА, YP – 7 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида Y. pseudotuberculosis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», утвержденные ректором Ульяновской ГСХА (3 сентября, 2010).

Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Разработанная схема выделения бактериофагов позволяет обнаружить и изолировать вирулентные фаги Y. pseudotuberculosis из объектов внешней среды.
  2. Выделенные и изученные штаммы бактериофагов Y. pseudotuberculosis пригодны для изготовления диагностического биопрепарата.
  3. Разработанная схема ускоренной идентификации бактерий вида Y.pseudotuberculosis позволяет выделить и идентифицировать бактерии данного вида за 48 часов.
  4. Разработанная схема ускоренной индикации бактерий вида Y.pseudotuberculosis методом РНФ позволяет обнаружить бактерии вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды в концентрации 103 – 101 м.к. в 1 мл за 19 – 28 часов, соответственно.
  5. Разработаны технологические параметры изготовления активного и специфического биопрепарата на основе псевдотуберкулезных фагов для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), «Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Ульяновск, 2006); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); Международных научно-практических конференциях: «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (Покров, 2009).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов YP – 2 УГСХА, YP – 7 УГСХА и индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (11 – 12 февраля 2010 года).

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГУ ВПО «Ульяновская ГСХА» «Диагностика и профилактика болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Пищевые инфекции» (номер Государственной регистрации 01200203524).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и список использованных литературных источников (230 всего, в том числе 60 зарубежных авторов). Работа изложена на 151 страницах текста, иллюстрирована 32 таблицами, 15 рисунками и дополнена приложениями.





СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы

Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), агар Эндо, среда для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Серова (пропись по методическим рекомендациям УлГУ, 1996), среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург), натрий хлорид, мочевина, желчь дегидратированная, трихлорметан.

Лабораторная посуда и оборудование: термостат ТС-80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42, холодильник бытовой, дистиллятор, лабораторные центрифуги ОПн-8УХЛ 4,2 и ЦЛС – 3, водяная баня, термометр ртутный, мультимедийный микроскоп «Биомед-6» с видеофотонасадкой, штативы, спиртовки, цилиндры мерные, флаконы, чашки Петри, пробирки, пипетки градуированные, колбы, стекла предметные и покровные.

Штаммы бактерий: в работе использовали 96 штаммов бактерий: 5 референс-штаммов бактерий вида Y. pseudotuberculosis, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА, а также 19 штаммов, выделенных нами из патологического материала, фекалий больных животных, объектов внешней среды; 72 штамма бактерий других родов и видов, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы (Y. enterocolitica – 17, Staphylococcus – 3, Escherichia – 5, Proteus – 5, Citrobacter – 5, Klebsiella – 5, Enterococcus – 5, Providencia – 5, Aeromonas – 5, Pseudomonas – 5, Salmonella – 3, Serratia – 2, Bacillus – 5, Shigella – 2).

Объекты внешней среды: водопроводная вода, сточные воды, фекалии животных, пищевое сырье, патологический материал от больных и павших животных.

Объектами исследования являлись 7 штаммов фагов бактерий вида Y. pseudotuberculosis, выделенные нами из объектов внешней среды.

Методы

Выделение и идентификацию бактерий вида Y. pseudotuberculosis проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ (1999), «Методическими указаниями по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах», утвержденными МСХ РФ (2005), «Методическими рекомендациями по эпидемиологии, клинике, диагностике и терапии псевдотуберкулеза и иерсиниоза» (Ценева, 2005). При необходимости использовали дополнительные тесты, изложенные в определителе бактерий Берджи (1997).

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов проводили с помощью методов, предложенных предложенным М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), С. Лурия, Д. Дарнелл (1970), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (2006). Постановку РНФ для индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961), В.Я. Ганюшкиным (1988).

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами (Ашмарин, 1962; Бейли, 1970) с использованием программ Statistica – 6.0, Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение бактериофагов Y. pseudotuberculosis

Необходимым этапом наших исследований являлось выделение бактериофагов Y. pseudotuberculosis из объектов внешней среды. В качестве материалов исследования использовали сточные воды и фекалии животных свиноводческих и молочно-товарных ферм, частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей, всего исследовано 52 пробы.

Исследуемый материал фильтровали через бумажный фильтр для освобождения от механических примесей. В колбу с 200 мл мясопептонного бульона вносили 50 мл исследуемого фильтрата сточных вод и по 1,0 мл 18-часовых культур бактерий Y. pseudotuberculosis. Содержимое колбы инкубировали в термостате при температуре 37 °С. Через 24 – 48 часов исследуемый материал из колбы переносили в стерильную пробирку, обрабатывали хлороформом (1:10), а также центрифугировали при 700 g в течение 30 минут с целью инактивации и удаления бактериальной массы. В качестве контроля на чашки засевали индикаторные штаммы бактерий вида Y. pseudotuberculosis методом агаровых слоев с 1 мл стерильного мясопептонного бульона.

Обработанный фильтрат исследовали методом агаровых слоев на присутствие псевдотуберкулезных бактериофагов. Наличие прозрачных негативных колоний или зон лизиса на газоне роста культуры указывало на присутствие бактериофага в исследуемом фильтрате.

Выделение чистых линий фага проводили путем последовательных пассажей морфологически однотипных негативных колоний. Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили методом пассирования фага на индикаторной культуре Y. pseudotuberculosis.

В результате исследований выделено 7 изолятов бактериофагов Y. pseudotuberculosis (табл. 1).

Таблица 1 – Источники выделения фагов Y. pseudotuberculosis

Фаги

Индикаторный штамм Y.ps.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.