WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Разработка лабораторных методов мониторинга листериоза на примере ульяновской области

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МЕРКУЛОВ АНАТОЛИЙ ВИКТОРОВИЧ

Разработка лабораторных методов мониторинга листериоза на примере Ульяновской области

03.00.23. - биотехнология

03 00 07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Ульяновск 2003

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии и лаборатории молекулярной диагностики Всероссийского государственного научно – исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич,

доктор биологических наук

профессор Обухов Игорь Леонидович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация – Московский государственный университет

прикладной биотехнологии.

Защита диссертации состоится « « 2004 в часов на заседании диссертационного Совета Д 220.061.04 при Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова в аудитории кафедры патологической анатомии и патологической физиологии сельскохозяйственных животных института ветеринарной медицины и биотехнологии по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова

Автреферат разослан « « …………………20004г.

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Листериоз и листерии широко распро­странены в окружающей среде. Они выделяются из почвенных и полных экосис­тем, из объектов внешней среды, циркулируют в организме и вызывают заболева­ния животных и человека( Бакулов И.А. Васильев Д.А. 1995). В связи с этим закономерно то пристальное внимание которое в последнее десятилетие привлечено к листериозной инфекции. Вместе с тем до настоящего времени в России не ясны ни истинный уровень заболеваемости листериозом, ни ее структура и динамика (Тартаковский И.С и др. 2002) Это объясняется, с одной стороны, отсутствием ряда нормативных документов в медицинской службе по индикации микроорганизма, с другой - несовер­шенством существующих методов индикации и их обилием не прошедшим аттестацию и рекомендацию для применения.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка и сравнительная оценка некоторых, методов индикации листерий в объектах

внешней среды, пищевых продуктах и патологическом материале.

Для достижения цели предусматривается решение следующих задач:

  • Выявить степень распространения листериоза в Ульяновской области и провести эпизоотологический анализ с созданием кадастра листериозной инфекции,
  • определить и использовать оптимальные методы индикации листерий для целей мониторинга и анализа распространения инфекции,
  • определить эффективность предложенной тест-системы «Листер» по сравнению с бактериологическими методами исследования на выявление возбудителя листериозной инфекции, что позволит рекомендовать ее в качестве метода индикации листерий и диагностического метода на листериоз.

Научная новизна. Впервые проведены исследования связанные с распостранением на территории Ульяновской области листериозной инфекции и создан кадастр по листериозу за последние 18 лет. Апробирована схема бактериологического исследования материала, позволяющая в короткие сроки с минимальными затратами, получить данные по контаминации листериями объектов окружающей среды, пищевых продуктов, патологического материала. Рекомендовано для диагностики листериоза использовать бактериологические методы, методы фагодиагностики в виде смешанных групп фагов L 2А и L 4А.

Доказана высокая сохранность гена гемолизина, что является основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования материалов из окружающей среды. Получены данные, свидетельствующие о высокой эффективности ПЦР-реакции по индикации листерий, по сравнению с бактериологическими методами исследования, что позволяет рекомендовать ее в качестве диагностического метода исследования.

Практическая значимость. 1. Создан кадастр по листериозу Ульяновской области, на основании которого проведён анализ распространения листериоза и даны практические рекомендации Ульяновскому областному управлению ветеринарии по профилактике данной инфекции.

2.Разработана тест-система «Листер» и подготовлены НТД – ТУ 9388-034-00008064-99 на указанную тест-систему «для выявления и идентификации Listeria monocytogenes методом полимеразной цепной реакции» и наставление по применению указанной тест-систему, утверждённые Департаментом ветеринарии МСХ РФ ……., чувствительность тест-системы составила 10 бактериальных клеток в 1 мл и предназначена для выявления ДНК Listeria monocytogenes в биологическом материале от сельскохозяйственных животных, не иммунизированных живыми противолистериозными вакцинами, а также от диких животных, грызунов, птиц, клещей, пищевых продуктов и объектов внешней среды.

Положения выносимые на защиту: - создание кадастра по листериозу на территории Ульяновской области,



-разработка оптимальной схемы бактериологческой индикации (мониторинга), для мониторинга,

-рекомендации по использованию для индикации листерий и диагностики листериоза бактериологических методов, РНФ со смешанными группами фагов, ПЦР тест- системы «Листер»,

-результаты по распространенности и сохранности гена гемолизина, что является основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования материала,

  • эффективность ПЦР-реакции по сравнению с бактериологическими методами исследования.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава УГСХА за 1995-2001 гг; межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, 2001); Всероссийской научной конференции ВГНКИ (Москва, 2001); и т д. В двух комиссионных испытаниях проводимых по заданию Департамента ветеринарии МСХ РФ и утверждённых директором ВНИИЗЖ в декабре 1998г и апреле 1999г, а также комиссионных испытаниях в УГСХА, утверждённых ректором в 2002 г.

Публикации. Основное содержание работы отражено в ….. печатных работах.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и библиографического списка использованной литературы. Работа содержит …. страницу машинописного текста, … рисунков, … таблиц и библиографический список использованной литературы включающий …. наименований, в том числе …. зарубежных изданий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования. При выполнении отдельных этапов работы использовали натрий хлористый (ГОСТ4233-77), формалин (ГОСТ 1625-75), кислоту борную (ГОСТ 9656-75), трихлоруксусную кислоту (чда), танин (ч) мертиолат натрия (Serva), аурамин (Serva), ДНКазу (марка А, НПО "Биолар"), РНК-азу (марка А, НПО "Биохимреактив"). Среды Гисса готовили согласно "Сборнику инструкций по общим методам контроля медицинских иммунобиологических препаратов", утвержденному приказом МЗ СССР № 31 от 31.01.83. Для бактериологического метода исследования использовали питательные среды и схемы посевов, изложенные в инструкциях МЗ РФ. Необходимые материалы для проведения исследований по типированию штаммов Listeria monocytogenes.Исследования по эффективности РНФ приведены в результатах собственных исследований

Оборудование. Центрифуга (не менее 5000 g); термостатируемая водяная баня (+56…58°С); термостаты (на +26…28°С и +37°С); мерная лабораторная посуда; ОСО мутности бактериальный взвесей ГИСК им.Л.А.Тарасевича; мерная лабораторная посуда.

Штаммы, животные. В работе использовали референс штаммы Listeria monocytogenes из коллекции УГСХА кафедры микробиологии которые в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этого вида морфологическими, культуральными, биохимическими и антигенными свойствами. Для выявления возбудителя Listeria monocytogenes методом полимеразной цепной реакции были использованы 23 типовых штамма Listeria monocytogenes.

Беспородные кролики весом 2.5-3 кг.

Методы Морфологию листерий этих серовариантов проверяли микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Мазки готовили из 18-24 часовых бульонных и агаровых культур. Культуральные свойства изучали посевами в бульон Хоттингера и на чашки с питательной средой для диагностики чумного микроба. Посевы инкубировали при температуре 28°С. Подвижность иерсиний определяли посевами культуры в 0,3% полужидкий агар. Биохимические свойства первоначально определяли по методике, рекомендованной Васильевым Д.А, которую при необходимости дополняли изучением сахаролитической активности в полном ряду Гисса. Бактериологические методы исследования и методы фаготипирования, методы постановки ПЦР описаны в результатах собственных исследований.

Результаты исследований.

Первое диагносцируемое появления листериоза на территории Ульяновской области относят к концу 50-х годов. Постоянная регистрация вспышек листериоза появилась с середины 80-х годов. В рис 1, 2 и 3 приведены данные кадастра по листериозу на территории Ульяновской области.

 исло неблагополучных пунктов по листериозу в Ульяновской области-0

Рис. 1 Число неблагополучных пунктов по листериозу в Ульяновской области (1985-2002гг)

Из 35 населённых пунктов Ульяновской области, пораженных листериозной инфекцией, в одном населённом пункте (Моисеевка) листериоз на протяжении изучаемых 18 лет встречается 6 раз, в другом (Слобода Выходцева) - 4 раза. В двух пунктах (Мордово Озеро и Новая Малыкла) – по 3 раза. В семи - (Старое Погорелово, Ховрино, Русские Горенки, Филиповка, Аллагулово, Степная Васильевка, Александровка) – по 2 раза. В остальных 24 пунктах за 18 лет листериоз регистрируется по одному разу. Однако в некоторых из этих хозяйств, например в хозяйстве «Теленское» за год было зарегистрировано 2 случая листериоза К.Р.С. И таких очагов, где в течение года регистрация листериоза прошла неоднократно насчитывается до 9 населенных пунктов.

Все эти показатели подтверждают вывод о том, что на территории Ульяновской области листериоз не случайная инфекция, а закономерная имеющая природно-очаговый характер.Анализ распространения листериозной





инфекции по Ульяновской области показывает, что в основном листериоз распространён в двух степных районах левобережья – Мелекесском и Новомалыклинском, а также в центральной части правобережья Карсунском, Вешкаймском, Ульяновском, Сенгилеевском, Майнском районах, которые непосредственно граничат друг с другом. Территории этих двух зон (районов) можно оценивать как территории эпизоотически неблагополучные по листериозу. По нашим данным в наибольшее количество случаев листериоза в Ульяновской области приходится на период марта-апреля. Из 63 случаев листериоза показатели сезонности по месяцам распределяются следующим образом: Январь-7, Февраль-6, Март-15, Апрель-8, Май-7, Июнь-2, Июль-3, Август-2, Сентябрь - не одного случая листериоза, Октябрь-3, Ноябрь-6, Декабрь-4. Данная закономерность практически соответствует общепринятой тенденции сезонности листериоза. Однако она связана скорее не с миграцией грызунов, как отмечал И.А. Бакулов, а с типом кормления животных и биологическими особенностями листерий.

 Рис 2. Сезонные изменения интенсивности эпизоотологического процесса В-1 Рис 2. Сезонные изменения интенсивности эпизоотологического процесса

В первую очередь это мелкий рогатый скот – 39 случаев из 63, что составляет 62% от всего поражённого поголовья, КРС соответственно 16слу

чаев -25% и свиньи 8 –13%. Данные цифры подтверждают общую тенденцию для листериоза – в первую очередь поражается МРС потом уже КРС, свиньи, наименее чувствительные к листериозу с-х животные.

Выше перечисленный анализ по распостранению листериоза на территории Ульяновской области позволяет сделать заключение, что данная инфекция, являющаяся природно - очаговой инфекцией в обозримом будущем не исчезнет с указанного региона. Всё это обосновывает необходимость налаживания и разрабатывания методов индикации и мониторинга появления листерий в той или иной местности, слежения за указанной инфекцией, предотвращения её распространения и угрозы заболевания людей и животных.

 Сравнительные показатели количеств неблагополучных пунктов по-2 Рис.3. Сравнительные показатели количеств неблагополучных пунктов по листериозу К.Р.С., овец, свиней в Ульяновской области за1985-2002г.г.

Индикация листерий бактериологическим методом.

Методы диагностики листериоза, схемы выделения и типирования листерий достаточно разнообразны, однако у каждой из них есть свои недостатки, в частности заключающиеся или в длительности исследования или в дороговизне реактивов и оборудования для бактериологического подтверждения выделенной культуры как листериозной. За период 1994-97 гг нами была разработана, апробирована, предложена и доложена на ряде конференций, следующая «быстрая» схема выделения и типирования листерий из тканевого материала и объектов окружающей среды. Данная схема исследования позволяет использовать её при проведении мониторинга листериозной инфекции. В качестве образца для исследования брали: патологический материал (печень), землю, сточные воды, свежескошенную траву. Образцы (изучаемый субстрат) контаминировали культурой листерий штаммом 766 в дозе 5 *10 2 КОЕ в мл (по результатам титрования). Далее исследования проводили по оптимальной схеме, выбранной из серии опытов.

Изучаемый субстрат независимо от его вида измельчают и смешивают со средой накопления в соотношении 1:8 (1 часть продукта и 8 частей среды) встряхивают в течение 1 минуты и культивируют при 28о С 24 – 48 часов. Через указанные сроки 1мл полученной бактериальной суспензии смешивают с 5 мл 0,1 – 0,3 %-ного раствора КОН (растворенного в 5%-ном NaCl ) встряхивают и через минуту высевают на селективный агар в двух повторах и через 24 – 48 часов культивирования при температурах 22 и 37о С проводят идентификацию выросших колоний. Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб. Первый этап исследования с использованием среды накопления позволяет выделить листериозную культуру у 80-92% исследуемых проб, при 100% контаминации исходного материала. Второй этап -обработка щелочным раствором КОН с последующим культивированием при 22 и 37 оС. позволяет к концу первых – вторых суток получить положительные результаты до 87-90% проб. Различные температурные режимы культивирования обусловлены биологическими особенностями листерий. К концу первых суток в при культивировании при 37оС можно идентифицировать листериозные культуры у 70-80 % проб. Культивирование при 22о С позволяет к концу 2-х суток идентифицировать до 90% проб. Используя данную двухступенчатую температурную схему мы сокращали сроки культивирования на 24 часа и только в сомнительных случаях режим в 22 оС потребовался для продолжения исследований.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.