WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов enterobacter, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Пожарникова Елена Николаевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ENTEROBACTER, КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ БИОПРЕПАРАТА И РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

03.00.07 – микробиология

03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Саратов – 2006

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Бактерии рода Enterobacter выделяют от больных животных и людей при острых желудочно-кишечных заболеваниях, инфекциях желчных и мочевыводящих путей, гнойных поражениях кожи, мозговых оболочек при сепсисе, внутрибольничных инфекциях. Эти микроорганизмы вызывают 5 - 10 % госпитальных бактериемий (Покровский, Дунаевский, 2001). Имеются данные о выделении патогенных штаммов Enterobacter из отдельных хозяйств при массовых диарейных заболеваниях телят и поросят (Воронин, Дервишов, 1989; Каврук, 1994; Золотухин, 1996; 2004).

Бактерии Enterobacter выделены неоднократно у больных с невыясненной этиологией острых кишечных заболеваний при различных диагнозах (кишечная дизентерия, простая или токсическая диспепсия, энтерит, гастроэнтерит), а также у больных с травмой черепа и развитием менингита. Нередко эти микроорганизмы выделяли из крови больных с клиникой сепсиса (Покровский, Дунаевский, 2001).

Исследователи, работающие в области лабораторной диагностики энтеробактериозов, подчеркивают трудность выделения бактерий рода Enterobacter из организма и различных субстратов. Возникает необходимость разработки более эффективных и менее трудоемких методов идентификации бактерий рода Enterobacter.

Об успешном использовании бактериофагов для лабораторной диагностики некоторых инфекционных заболеваний и индикации возбудителя в объектах внешней среды сообщают многие исследователи (Васильев, Померанцев, 1999; Золотухин с соавт., 2005; Перелыгин с совт., 2005; Натидзе с соавт., 2005; Каллавей с соавт., 2005).

Проблеме выделения и изучения бактериофагов посвящено большое число работ, однако недостаточно изучены бактериофаги бактерий рода Enterobacter, которые имеют этиологическое значение в патологии животных и человека.

В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызванных бактериями рода Enterobacter, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по биохимическим свойствам (Покровский, Поздеев, 1999). Этот метод трудоемок, требует выделения чистой культуры, затрат времени, питательных сред и реактивов. Использование метода фагодиагностики позволяет сократить время постановки диагноза с нескольких суток до 19 – 40 часов (Земцова, 1965; Тимаков, Гольдфарб, 1956, 1962). Что говорит об актуальности исследований бактериофагов бактерий рода Enterobacter и изучения возможности их применения в диагностических целях.

Цель исследования. Разработка параметров и технологических приемов по индикации и идентификации бактерий рода Enterobacter в объектах внешней среды с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования:

  1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий Enterobacter.
  2. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.
  3. Подобрать оптимальный набор бактериофагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат – диагностикум.
  4. Разработать схему идентификации бактерий рода Enterobacter с помощью бактериофагов.
  5. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Enterobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
  6. Разработать биотехнологические параметры изготовления диагностического фагового препарата.

Научная новизна. Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Enterobacter, выделенных от сельскохозяйственных животных. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схема фагодиагностики.

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении патогенных штаммов бактерий рода Enterobacter, выделенных от сельскохозяйственных животных. Фаги депонированы во Всероссийском государственном центрекачества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ).

Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю серии индикаторных бактериофагов Enterobacter En – 2 УГСХА, En – 13 УГСХА», утвержденная ректором Ульяновской ГСХА 17.01.2006 года.

Для врачей бактериологов предложены «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий рода Enterobacter в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды» и «Методические рекомендации по выделению и фагоидентификации бактерий рода Enterobacter из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов En – 2 УГСХА, En – 13 УГСХА», которые были одобрены Ученым советом УГСХА и утверждены ректором академии 17.01.06 г.



Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Схема выделения бактериофагов энтеробактерий рода Enterobacter.
  2. Биологические свойства выделенных бактериофагов бактерий рода Enterobacter.
  3. Конструирование из отобранных фагов нового биопрепарата – диагностикума.
  4. Разработка схемы ускоренной индикации бактерий рода Enterobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
  5. Разработка схемы идентификации бактерий рода Enterobacter с помощью специфических бактериофагов.
  6. Разработка биотехнологических параметров диагностического фагового препарата.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных (Москва, 2005; Ульяновск, 2006), всероссийской (Ульяновск, 2004), межрегиональных (Самара, 2004; Чебоксары, 2006) научно-практических конференциях.

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов Еn - 2 УГСХА, Еn - 13 УГСХА и индикации бактерий рода Enterobacter в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.06) и во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ) (от 21.02.06.).

Работа выполнена в рамках научно-исследовательской темы «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных» кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии в 2002 – 2006 годах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения и список литературных источников (187 всего, в том числе 150 отечественных). Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста (шрифт 14 Times New Roman, интервал полуторный) и иллюстрирована 33 таблицами, 14 рисунками и дополнена приложениями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Штаммы: В работе использованы 21 штамм бактерий рода Enterobacter, 114 штаммов гетерологичных родов Klebsiella, Citrobacter, Escherihia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Morganella, Pseudomonas, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ), выделенные из объектов окружающей среды и патологического материала. 21 изолят бактериофагов бактерий рода Enterobacter, выделенные из объектов окружающей среды.

Питательные среды: Для бактериологического исследования использовали питательные среды: мясопептонный бульон, мясопептонный агар 0,3 %-ный, 0,7 %-ный, 1,5 %-ный, среда Эндо (производство ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск Серпуховского района Московской области); агар Плоскирева («Биотехновация», г. Москва); агар Симмонса, ацетатный агар (производство «Биомед» им. Мечникова, Московская область); среда с малонатом, среда с фенилаланином (НИИ питательных сред, г. Махачкала); среды Гисса (лактоза, сахароза, глюкоза, маннкубальтоза) с индикатором ВР (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); висмут-сульфит агар («Pronadisa», Madrid), трихлорметан чда ТУ 6-09-4263-76 (СКТБ «Технолог»).

Лабораторная посуда и оборудование: термостат ТС – 80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42, холодильник бытовой, дистиллятор, центрифуга лабораторная ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС – 3, водяная баня, микроскоп МБИ-3, микроскоп ХSZ-104, электронный микроскоп JEM – 100В (г. Москва), мерные цилиндры, флаконы, чашки Петри, пробирки, пипетки мерные, колбы, мерные стаканы и мензурки, штативы, спиртовка, стекла предметные, стекла покровные.

Методы. В исследованиях для выделения бактерий рода Enterobacter мы использовали методы, приведенные в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П 11 октября 1999 года.

Выделение бактериофагов проводили по методам, предложенным Л.И. Адельсон (1957; 1962), С. Лурия, Д. Дарнел (1970), И.П. Ревенко (1978), В. Я. Ганюшкин (1988), С.В. Ленев (1991). Изучали биологические свойства фагов по методам, предложенным М. Адамс (1961), Д.М. Гольдфарб (1961), А.С. Тихоненко (1968), И.М. Габрилович (1992), В.Я. Ганюшкин (1988), H.-W.Ackermann (1997). Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной и использованной И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994). Обнаружение бактерий рода Enterobacter в объектах окружающей среды проводили с помощью РНФ. Реакцию нарастания титра фага ставили по методике В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1961), В.Я. Ганюшкин (1988).





Статистическую обработку результатов исследований проводили общеприняты статистическими методами (Ашмарин, Воробьев, 1962; Бейли 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск и селекция бактериофагов

Для выполнения диссертационных исследований необходимо выделить и изучить бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Enterobacter.

Первоначально мы исследовали имеющиеся штаммы Enterobacter на наличие профага. В первой серии опытов мы использовали методику, предложенную Д.М. Гольбфарбом (1961), для выделения бактериофагов без воздействия индуцирующего фактора. Результаты исследований свидетельствуют, что культуры Enterobacter в опытах по выделению фагов без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Во второй серии опытов на культуры Enterobacter воздействовали индуцирующим фактором (Лурия, Дарнелл, 1970). В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами и хлороформом. Облучение суточных культур проводили в течение 10, 20, 30 и 40 минут при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8, 18 % мощности которой приходится на область 254 нм. Параллельно культуры обрабатывали суспензию хлороформом из расчета 10:1. В наших исследованиях имеющиеся штаммы рода Enterobacter после воздействия ультрафиолетового облучения и хлороформа не проявили лизогенных свойств. Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что мы не обнаружили явления лизогении у исследуемых культур.

Следующим этапом наших исследований стало выделение бактериофагов Enterobacter из объектов внешней среды (Гольдфарб, Тимаков, 1961). Материалом для выделения являлись сточные воды и фекалии животных свиноводческих и молочно-товарных ферм, частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей. В результате исследований сточных вод удалось по указанной схеме выявить 21 изолят фагов. Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили пассированием фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной и использованной И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994). В результате проведенных опытов, нами было выделены и отселекционированы 21 штамм фагов бактерий рода Enterobacter.

Характеристика фагов Enterobacter

а) Морфология негативной колонии. Для определения морфологии негативной колонии мы высевали фаг в разведении 10-7 – 10-9 степени на чашки методом агаровых слоев. Для формирования газона на поверхности агара использовали штамм Enterobacter, на которые фаг был выделен. Посевы культивировали в термостате при температуре 370С. Изучение морфологии негативных колоний проводили через 24 часа.

Негативные колонии разделили на два типа. К первому относятся негативные колонии круглые прозрачные диаметром более 3 мм с зоной неполного лизиса по периферии шириной 0,5 – 4 мм. Негативные колонии первого типа формируют фаги Еn-1 УГСХА, Еn-2 УГСХА, Еn-3 УГСХА, Еn-4 УГСХА, Еn-5 УГСХА, Еn-6 УГСХА, Еn-7 УГСХА, Еn-8 УГСХА, Еn-10 УГСХА, Еn-14 УГСХА, Еn-19 УГСХА. Колонии второго типа круглые прозрачные с ровными краями имеют диаметр до 3 мм, отличаются отсутствием зоны неполного лизиса. Колонии второго типа образуются фагами Еn-9 УГСХА, Еn-11 УГСХА, Еn-12 УГСХА, Еn-13 УГСХА, Еn-15 УГСХА, Еn-16 УГСХА, Еn-17 УГСХА, Еn-18 УГСХА, Еn-20 УГСХА, Еn-21 УГСХА.

б) Литическая активность. Литическая активность бактериофага оценивают по его способности вызывать лизис бактериальной культуры и выражают это тем максимальным разведением, в котором испытуемый фаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Активность исследуемых бактериофагов варьировала от 2 х 105 до 1,6 х 1010 корпускул в 1 мл.

Таблица 1

Литическая активность фагов бактерий рода Enterobacter

№ пп

Фаг

Индикаторная культура

Активность по Аппельмана, степень разведения

Активность по Грациа, корпускул в 1 мл

1

Еn-1 УГСХА

E.cloacae № 10005

10-10

9 х 108

2

Еn-2 УГСХА

E.cloacae № 10005

10-9

1,2 х 109

3

Еn-3 УГСХА

E.cloacae № 10005

10-8

1,6 х 109

4

Еn-4 УГСХА

E.cloacae № 10005

10-6

3 х 107

5

Еn-5 УГСХА

E.cloacae № 10005

10-9

3 х 108

6

Еn-6 УГСХА

E.cloacae № 10005

10-6



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.