WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий pseudomonas aeruginosa

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Шестаков Андрей Геннадьевич

усовершенствование методов выделения, идентификации и ИНДИКАЦИИ бактерий Pseudomonas aeruginosa

03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Саратов – 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич

кандидат ветеринарных наук, доцент

Богданов Ильгизар Исмаилович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тихомирова Елена Ивановна

доктор биологических наук

Селянинов Юрий Олегович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва

Защита диссертации состоится « 25 » ноября 2010 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан « » октября 2010 г. и размещен на сайте: http://sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa вызывают заболевание «псевдомоноз» к которому восприимчивы: крупный рогатый скот, свиньи, овцы, птица, пушные звери, пчёлы, рыбы, из лабораторных животных чувствительны белые мыши, морские свинки и кролики (Lipej et al., 1993; Прунтова и др., 1995; Покровский 2002). Диагноз ставят на основании лабораторных исследований на P. aeruginosa. Источник возбудителя, больные животные, выделяющие его с различными выделениями, калом, мочой, молоком, со спермой. Факторы передачи возбудителя – инфицированные корма, пищевое сырьё, вода, почва, окружающая среда (Сидоров, 1995; Красильников, 1999). По существующим данным в окружающей среде P. aeruginosa паразитирует в простейших (Ряпис, 1994; Бухарин, Розенберг, 2007). На особом месте стоит водный ареал распространения P. aeruginosa (Смирнов, Киприанова, 1990; Афонин, 1999).

Отмечена высокая резистентность бактерии к антибиотикам и антимикробным веществам (Nikaido, 1978; Илюхин, 1985). P. aeruginosa вызывает порчу белковых пищевых продуктов (в первую очередь мясомолочных) (Стефанов, 1997). Сообщается, что P. aeruginosa вызывает деструкцию нефтепродуктов и углеродсодержащих веществ (Al-Hadhrami, Lapin-Scott, Ficher, 1995). Несмотря на то, что потребность в диагностике синегнойной инфекции очевидна, существующие бактериологические параметры схем, методов выделения, идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах не совершенны. Трудности диагностики P. aeruginosa связаны с беспигментными штаммами и ассоциативной микрофлорой (Шуляк, 2003). В связи с этим исследования, посвященные методам быстрого и точного обнаружения P. aeruginosa в объектах окружающей среды, пищевом сырье и пищевых продуктах являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.

Цель работы - совершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий вида P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Задачи работы:

1. Изучить основные биологические свойства штаммов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

2.Усовершенствовать среды для выделения и идентификации атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa.

3. Усовершенствовать схему бактериологической идентификации и дифференциации P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и тестов.

4. Выделить из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов специфические бактериофаги бактерий P. aeruginosa и изучить их основные биологические свойства; отобрать наиболее оптимальный специфический бактериофаг для конструирования биопрепарата.

5. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат и технологию его изготовления для индикации и идентификации бактерий вида P. aeruginosa.

6. Усовершенствовать схему индикации бактерий P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4, методом реакции нарастания титра фага.

Научная новизна. Проведены комплексные исследования по выделению и из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов штаммов P. aeruginosa. Получены новые данные о биологических свойствах атипичных и беспигментных штаммах, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструирована новая специфическая среда накопления. Усовершенствована селективная среда с цетримидом для выделения атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa. Отобран ряд наиболее информативных тестов и разработаны дополнительные тесты, позволяющие проводить видовую дифференциацию бактерий рода Pseudomonas с учётом существующих беспигментных штаммов.



Усовершенствована схема выделения и бактериологической идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги P. aeruginosa, и отобран наиболее оптимальный специфический бактериофаг УГСХА-Р.а.№4 для создания диагностического биопрепарата.

Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата и усовершенствована схема индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов c применением специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4.

Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема бактериологической идентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать атипичные, беспигментные штаммы P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Использование сконструированной нами среды накопления, усовершенствованной селективной среды и подобранных тестов бактериологической идентификации, позволяет выделять и типировать бактерии P. aeruginosa до вида в течение 75 часов. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичного бактериофага и усовершенствована схема индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 19-20 часов.

Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, а также возможность использования диагностического биопрепарата специфичного бактериофага УГСХА-P.a.4 в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 22 января 2010г.

По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 феврвля 2010г) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага УГСХА-P.a.№4», а так же «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации разработаны для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среда накопления (УГСХА-Р.а.1) способствует избирательному росту и размножению P. aeruginosa, при первичном посеве исследуемого материала. Плотная селективная среда (УГСХА-Р.а.2) является специфичной и обеспечивает преимущественный рост P. aeruginosa, угнетая рост возможных ассоциантов.

2. Использованные среды УГСХА-Р.а.1 и УГСХА-Р.а.2, а также подобранные тесты в усовершенствованной схеме бактериологической дифференциации дают возможность за 75 ч идентифицировать P. aeruginosa.

3. Отобран штамм специфического бактериофага для целей идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

4. Разработаны биотехнологические параметры по созданию диагностического биопрепарата специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4.

5. Усовершенствованная схема идентификации бактерий вида P.aeruginosa с применением диагностического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 ускоряет определение видовой принадлежности P. aeruginosa.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2005; 2008; 2009), Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения и двух глав: обзора литературы; собственных исследований, состоящих из объектов, материалов и методов исследований; результатов исследований и их обсуждения; заключения; выводов; списка использованных литературных источников; приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 33 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 203 наименования, в том числе 111 зарубежных.





СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект, материалы и методы исследований

Штаммы: в работе было использовано 4 референс-штамма бактерий P. aeruginosa 128, 1677, 381, 453, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГОУ ВПО Ульяновской ГСХА, а также 35 штаммов, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Кроме того, для определения специфичности сконструированных сред, а также изучения специфичности бактериофагов использовали 16 штаммов бактерий: Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Stenotrophomonas maltophila из музея вышеназванной кафедры. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами. Объектами исследования так же являлись семь штаммов бактериофагов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды.

Питательные среды и реактивы: МПА (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), МПБ (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Левина (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Плоскирева (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда висмут-сульфит агар (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург), среда АГВ для определения антибиотикочувствительности, диски с антибиотиками (НИЦФ Санкт-Петербург), хлорид бария, хлорид натрия, ацетамид, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магния сульфат, нитрат калия, пептон сухой ферментативный, глюкоза, сукцинат натрия, L-аргинин, N-N-диметилпарафенилендиамин, перекись водорода, индикатор феноловый красный, индикатор бромтимоловый синий, фурадонин, цетримид, агар-агар, желатин, трихлорметан, ТТХ, набор для окраски по Граму.

Методы: В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения, идентификации и индикации бактерий (Васильев и др., 2004; Лабинская, 2004). Основные биохимические свойства штаммов P. aeruginosa исследовали экспресс методом с использованием тест системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, разработанной в НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург. Оксидазный тест проводили с применением 1% р-ра N-N-диметилпарафенилендиамина. Тест на каталазную активность проводили с применением 3% р-ра перекиси водорода. Исследования с использованием бактериальных штаммов проводили согласно ГОСТ Р 51446-99, ГОСТ Р 51426-99, ГОСТ Р 26670-91.

Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (2007). Литическую активность фагов определяли по Аппельману и Грациа (Гольдфарб, 1961). Реакцию нарастания титра фага для индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962), В.Я. Ганюшкиным (1984).

Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Ашмарин, Воробьев, 1962; Бейли, 1970). Обработку результатов осуществляли с помощью программы SPSS statistics 17.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рост референс-штаммов Pseudomonas aeruginosa на

стандартных средах и образование пигментов

Нами исследованы тинкториальные и культуральные свойства 4-х референс-штаммов P. aeruginosa для определения стабильности свойств и их обоснованного использования при составлении бактериологической схемы выделения и идентификации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

Все референс-штаммы P. aeruginosa, окрашенные по методу Грама, были представлены мелкими грамотрицательными палочками. Подвижность клеток



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.