WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Влияние гидратированного фуллерена с60 в широком диапазоне концентраций на биологические тест-системы

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Яблонская Ольга Игоревна

ВЛИЯНИЕ ГИДРАТИРОВАННОГО ФУЛЛЕРЕНА С60 В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

03.01.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МОСКВА 2013

Работа выполнена на кафедре биоорганической химии Биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:
Доктор биологических наук,
профессор
Воейков Владимир Леонидович
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем ИБХФ РАН

Пальмина Надежда Павловна
Доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Доронин Юрий Константинович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино

Защита диссертации состоится «29» мая 2013 г. в 12.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан 19 апреля 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.039.01

кандидат химических наук Мазалецкая Л.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: Фуллерены (С60, С70 и т.д.) являются аллотропной формой углерода [Сидоров и др., 2005]. Наиболее стабильный изомер С60 проявляет свойства ненасыщенного полиалкена и обладает структурой усeченного икосаэдра. Сейчас во всем мире уделяется самое пристальное внимание перспективам применения фуллеренов в физике, в химии, в области нанобиотехнологий и медицины.

Фуллерен практически не растворим в воде (его растворимость <10-9мг/л) [Ruoff et al., 1993; Heymann, 1996]. В 1995 году без использования каких-либо солюбилизаторов и специальной химической модификации была получена устойчивая композиция фуллерена и воды, получившая название гидратированного фуллерена С60 (HyFn). Эта композиция соответствует всем характеристикам истинного раствора, и концентрация С60 в нем достигает 2,0 мг/мл и более [Andrievsky et al., 1995].

Гидратированный фуллерен HyFn – это молекула C60-фуллерена, окруженная оболочкой молекул воды и образующая истинные водные растворы. Исследования биологической активности HyFn и его химически модифицированных аналогов показали, что они обладают антивирусным, антиамилоидным, антиаллергическим, противоопухолевым, гепатопротекторным, антиатеросклеротическим действием, стимулируют иммунитет и препятствуют возрастным изменениям в организмах [Andrievsky et al, 2005; Bakry et al, 2007; Baati et al, 2012]. При этом HyFn не проявляет признаков токсичности даже в высоких дозах.

С одной стороны, HyFn можно рассматривать как сильный акцептор электронов, антиоксидант, с другой – как активатор для кислорода, т.е. прооксидант. Учитывая, что молекула С60 проявляет слабую химическую активность, а в составе HyFn она заключена в водную оболочку, можно предположить, что весь спектр действия HyFn можно объяснить свойствами водных оболочек, формирующихся вокруг молекул С60.

Поскольку HyFn положительно влияет на многие биологические процессы in vivo, представляется важным исследовать действие этого соединения с использованием широкого спектра модельных биологических систем.

Цель данной работы заключалась в изучении влияния HyFn в широком диапазоне концентраций (110-6 М - 110-23 М), на различные биологические объекты: ферменты, неразбавленную кровь человека и трансформированные фибробласты китайского хомячка.

Основными задачами исследования являлись:

1. Изучить влияние HyFn в широком диапазоне концентраций на активность бактериальной люциферазы, щелочной фосфатазы и пероксидазы в условиях продолжительного хранения и при термической инактивации. Изучить сроки и условия хранения растворов HyFn в низких концентрациях.

2. Изучить влияние HyFn в широком диапазоне концентраций на люцигенин-зависимую хемилюминесценцию (ЛЦ-ХЛ) неразбавленной крови человека. Сравнить это влияние на кровь здоровых доноров и пациентов с ХОБЛ.



3. Изучить влияние HyFn в сверхнизкой концентрации на трансформированные фибробласты китайского хомячка. Оценить влияние препарата на скорость роста культуры клеток и на скорость старения.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. HyFn оказывает стабилизирующее действие на ферменты, предохраняя их от термической и окислительной инактивации.
  2. HyFn в определенных концентрациях усиливает интенсивность ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека, причем этот эффект не обнаружен на крови пациентов с ХОБЛ. Добавление HyFn снижает дисперсию показателей хемилюминесценции крови в группах пациентов с разной тяжестью течения заболевания, поэтому может служить диагностическим методом.
  3. HyFn подавляет пролиферацию трансформированных клеток, а также ускоряет их гибель.
  4. HyFn оказывает все вышеперечисленные эффекты на биологические объекты в малых и сверхмалых концентрациях. Это указывает на то, что его про- и антиоксидантная активность опосредована воздействием на водную среду этих объектов.

Научная новизна исследования:

Впервые изучено защитное влияние HyFn в широком диапазоне концентраций (10-7 М – 10-23 М) на бактериальную люциферазу, щелочную фосфатазу и пероксидазу в условиях термической и окислительной денатурации. HyFn в сверхмалых концентрациях модулирует эффект окислителей, восстановителей и антиоксидантов (окисление, Fe2+, глицин) на ферменты. Определены сроки и условия хранения HyFn.

Впервые изучено стабилизирующее влияние HyFn в низких и сверхнизких концентрациях (10-6 М, 10-7 М, 10-17 М, 10-19 М) на ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека в течение нескольких суток. Показано, что HyFn в этих концентрациях снижает интенсивность ЛЦ-ХЛ крови пациентов с ХОБЛ. Влияние HyFn на кровь пациентов с ХОБЛ зависит от степени тяжести заболевания.

Впервые было изучено воздействие HyFn на скорость роста культуры трансформированных фибробластов китайского хомячка. Показано снижение скорости пролиферации культуры клеток, усиление гибели культуры и снижение эффективности образования колоний клетками в присутствии HyFn.

Впервые обнаружено, что HyFn в концентрациях 10-6М, 10-7 М, 10-9 М, 10-17 М и 10-19 М оказывает наиболее выраженное неспецифическое влияние на разные биологические объекты. В частности, он стабилизирует активность изученных ферментов, способствует длительному сохранению активности; стабилизирует интенсивность ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека и ускоряет гибель культуры трансформированных клеток.

Теоретическая и практическая значимость исследования:

Работа вносит определенный вклад в понимание характера воздействия HyFn на разные биологические объекты в диапазоне малых и сверхмалых доз, что даст возможность установить механизм и принцип его действия с учетом низкой химической активности собственно С60.

Лабораторные исследования других авторов показали, что HyFn обладает терапевтическими свойствами, оказывая антибактериальное, гепатопротекторное, противовирусное, нейропротекторное и другие эффекты. Предполагается, что это влияние HyFn связано с его способностью модулировать свободно-радикальные процессы в живых системах, которые играют важную роль в регуляции жизнедеятельности. Обнаруженное в настоящей работе стабилизирующее влияние HyFn в сверхмалых дозах на ферменты представляет практический интерес для его использования в качестве консервирующего агента. Противоположный отклик крови здоровых доноров и больных ХОБЛ на введение в кровь HyFn позволяет рассмотреть возможность использования его для диагностических и терапевтических целей. Результаты данного исследования могут быть использованы в курсах лекций по биофизике и клеточной биологии.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры биоорганической химии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (тема НИР: «Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах», № Госрегистрации 01.2001.17.408).

Вклад автора: Личный вклад диссертанта состоит в разработке и проведении биофизических экспериментов, обработке и анализе полученных данных, формулировании положений и выводов, в подготовке тезисов конференций и статей к опубликованию. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором лично или при его непосредственном участии.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (2008 г., ИБХФ РАН, Москва), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (2010 г., ИБХФ РАН, Москва), Международной конференции «Ломоносов-2010» (2010 г., МГУ имени М.В.Ломоносова), III Евразийском конгрессе по медицинской физике (2010 г., МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва), IX Международной крымской конференции «Космос и Биосфера» (2011 г., Алушта, Крым, Украина), X Международном симпозиуме "Биологические механизмы старения" (2012 г., Харьков, Украина), VI Международном конгрессе “Low and Superlow Fields and Radiations in Biology and Medicine” (2012 г., Санкт-Петербург), the 17th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (ISBC 2012) (2012 г., Guelph, Ontario, Canada) (ISBC 2012), XVI международном научном конгрессе «Наука. Информация. Cознание» (2012 г., Санкт-Петербург).





Публикации: По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК, 1 статья в рецензируемом зарубежном журнале, 2 статьи в сборниках трудов международных конференций, 12 тезисов докладов, представленных на российских и международных конференциях.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 130 страницах печатного текста, содержит 39 рисунков и включает разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Литература». Библиографический список включает 204 ссылки на научные публикации, в том числе 76 источников на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во «Введении» обоснована актуальность темы, сформулирована цель и основные задачи работы, охарактеризована научная новизна полученных результатов.

Вторая глава содержит обзор литературы по теме данного исследования. В нем описана структура и свойства фуллерена С60 и HyFn. Описаны процессы генерации АФК, даны характеристики ферментов, неразбавленной крови человека и клеточных моделей. Изложены доступные в литературе представления о действии биологически активных веществ в сверхмалых дозах, свойства структурированных вод и их роль в свободно-радикальных процессах, протекающих в водных системах.

Третья глава посвящена описанию оборудования, реактивов и методики экспериментов. В Разделе 3.1. описаны источники использованных реактивов и их характеристики.

В Разделе 3.2. описаны методики опытов с ферментами: бактериальной люциферазой Vibrio fischeri, щелочной фосфатазой E.coli и пероксидазой Aromoracia rustanica. Растворы HyFn готовили из исходного раствора HyFn с концентрацией 210-4 М путем последовательных разведений. Порцию исходного раствора разбавляли в 200 раз в буфере, воде или физиологическом растворе для получения 110-6 М раствора HyFn. Раствор интенсивно встряхивали и оставляли на 30 минут в темноте. Далее 300 мкл 110-6 М раствора добавляли в 2700 мкл воды или буфера для получения 110-7 М раствора HyFn. Для получения HyFn в концентрации 110-9 М готовили сотенное разведение 110-7 М раствора. Растворы интенсивно встряхивали и оставляли на 30 минут в темноте. Эту процедуру повторяли для получения каждого разведения раствора HyFn.

Оценку уровня каталитической активности люциферазы проводили методом измерения интенсивности хемилюминесценции в реакционной смеси. ХЛ-излучение люциферазы регистрировали работающими в режиме счета одиночных фотонов люминометрами - «Биотокс 7А», «Биотокс 7», «Биотокс-7С» (АНО «Инженерный центр-экология», Россия). Реакционные смеси содержали 510-4 мг/мл фермента, FMN, NADH и деканаль. Смеси встряхивали и помещали в измерительную камеру счетчика фотонов.

Каталитическую активность щелочной фосфатазы и пероксидазы измеряли фотометрическим методом при помощи спектрофотометра Specord Analytik Jena (Германия). Использовали кварцевые и стеклянные кюветы. В опытах со щелочной фосфатазой кюветы содержали фермент, буфер pH 7,8 с HyFn, соли магния и цинка. Реакцию инициировали добавлением 4-нитрофенилфосфата (субстрата) непосредственно перед измерением оптической плотности при длине волны 410 нм. В опытах с пероксидазой реакционная смесь содержала 0,067 М фосфатный буфер (pH 6,5) с HyFn, 2,2 мг/мл пероксидазы, пероксид водорода и 2,2'-азино-ди[3-этил]-бензтиазолинсульфоновая кислота АБТС (субстрат). Каталитическую активность контролировали при длине волны 405 нм.

Описана методика опытов по изучению влияния HyFn на цельную неразбавленную кровь человека. Использовали кровь здоровых доноров и пациентов с ХОБЛ. К крови добавляли HyFn и люцигенин, и далее измеряли ЛЦ-ХЛ при помощи люминометра «Биотокс 7А».

Описана методика культивирования трансформированных фибробластов китайского хомячка линии B11-dii FAF28. Клетки сеяли в стеклянные флаконы в опытах по изучению скорости роста культуры и в пластиковые чашки Петри в опытах по изучению эффективности образования колоний.

В Четвертой главе приводятся результаты исследования.

В разделе 4.1 дана характеристика водного раствора фуллерена. Получен спектр поглощения раствора HyFn. Установлено, что по спектральным характеристикам полученный нами препарат фуллерена полностью совпадает с описанными в литературе [Andrievsky et al., 2002].

 Влияние длительной инкубации люциферазы при комнатной-0

 Влияние длительной инкубации люциферазы при комнатной-1

 Влияние длительной инкубации люциферазы при комнатной температуре-2

 Влияние длительной инкубации люциферазы при комнатной температуре в-3

Рис.1. Влияние длительной инкубации люциферазы при комнатной температуре в присутствии HyFn в различных концентрациях на ее активность. На графике приведены средние значения из 12 опытов. Приведены значения стандартных отклонений.

Рис.2. Изменение активности щелочной фосфатазы после нагревания до 80оС в течение 5 мин. 1 – контроль без нагревания; 2 – HyFn добавлен после нагревания, конц HyFn 10-17 M; 3- HyFn добавлен до нагревания, конц HyFn 10-17 M; 4 – термоинактивированный контроль без добавления HyFn.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.