WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 |

Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КУРЕК ДЕНИС ВЯЧЕСЛАВОВИЧ





Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами

03.01.06 Биотехнология (в том числе и бионанотехнологии)





АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва, 2011

Работа выполнена в лаборатории инженерии ферментов Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Варламов Валерий Петрович

кандидат химических наук

Лопатин Сергей Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Штильман Михаил Исаакович

доктор химических наук

Марквичева Елена Арнольдовна

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений

имени А. Н. Несмеянова РАН

Защита состоится «16» февраля 2011 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «14» января 2011 г.

Учёный секретарь

специализированного совета,

доктор физико-математических наук

Олейников В.А.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Рекомбинантные белки получают с использованием ДНК, в структуру которой введен ген другого организма, включая растения или животных, в том числе и человека. Важной особенностью получения рекомбинантных белков является высокая степень экспрессии целевого белка, иногда на несколько порядков превышающая уровень экспрессии в клетках родного организма. Последние два десятилетия одновременно с совершенствованием технологий получения рекомбинантных белков расширялись и области их применения в медицине и биотехнологии. Рекомбинантные белки уже широко используются в фармацевтике и медицине для лечения заболеваний, получения антител, иммуноферментного анализа или диагностики. Увеличивается и спектр использования рекомбинантных белков для научных целей. В первую очередь это получение новых ферментов с еще не известной структурой и свойствами в удобной системе экспрессии и дальнейшая очистка для последующих кристаллографических и физико-химических исследований.

В связи с расширяющимся спектром применения возникают и новые требования к качеству, универсальности методов и объемам получаемых рекомбинантных белков. С каждым годом увеличивается и разнообразие получаемых рекомбинантных белков, что требует разработки универсальных систем экспрессии и методов очистки. Использование таких универсальных систем позволит снизить стоимость получения и сделать более удобным сам процесс, часто являющийся лишь одной из стадий более масштабного исследования или производства. Кроме того, в случае применения в медицине или для исследования пространственного строения новых ферментов возникают высокие требования к степени очистки получаемых рекомбинантных белков, требующие совершенствования уже существующих или разработки новых методов постэкспрессионной очистки целевых белков.

В настоящий момент наиболее эффективным и самым широко распространенным методом очистки рекомбинантных белков является метод аффинной хроматографии. Принцип аффинной хроматографии базируется на уникальном сродстве различных молекулярных единиц друг к другу, например, фермент – ингибитор, фермент – субстрат, фермент – кофактор. Однако главным недостатком до определенного времени была узкая специфичность таких систем очистки – каждая система могла использоваться только для очистки лишь единичного белка. Разработанный в конце двадцатого века метод использования аффинных лигандов для очистки позволил преодолеть этот недостаток аффинной хроматографии, сделав ее универсальной. Аффинные лиганды представляют собой полипептидные вставки, встраиваемые в структуру целевого рекомбинантного белка с С- или N- конца, и имеющие высокое сродство к сорбенту. Использование аффинных лигандов позволяет производить одностадийную высокоэффективную очистку различных целевых белков из сложной смеси, используя при этом одну и ту же систему аффинной хроматографии. Более того в некоторых случаях использование аффинного лиганда может способствовать улучшению растворимости целевого белка. Появившаяся одной из первых и до сих пор широко применяемая система, использующая гексагистидиновый лиганд в сочетании с металлохелат аффинной хроматографией хотя и обладает целым рядом преимуществ, но и не является универсальной. Данная метка за счет своего малого размера практически не влияет на экспрессию или фолдинг целевого белка, а сам метод очистки является экономичным и удобным в рутинном использовании. Однако и такой вариант имеет ряд недостатков, таких как очистка нативных металлозависимых или богатых гистидинами балластных белков клетки продуцента помимо целевого белка. Поэтому на сегодняшний день существует целый ряд коммерческих аффинных лигандов, использующих различные варианты хроматографии и различающихся по своему размеру, свойствам и условиям очистки. Уже разработаны коммерчески доступные системы очистки, использующие субстратсвязывающие домены в качестве аффинных лигандов. Однако, например, в случае хитинсвязывающих доменов существует лишь одна дорогостоящая и не являющаяся оптимальной система очистки. Таким образом, на сегодняшний день не существует универсальной системы аффинной очистки рекомбинантных белков, и исследования в этой области продолжаются.



Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка новых аффинных сорбентов на основе хитина или хитозана для использования их в сочетании с хитинсвязывающим аффинным лигандом для очистки рекомбинантных белков; подбор и оптимизация хроматографических параметров метода для получения наиболее эффективных результатов; исследование условий и особенностей сорбции модельных рекомбинантных белков на полученных сорбентах.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

  1. Синтезировать новые аффинные сорбенты на основе хитина или хитозана.
  2. Изучить их хроматографические и физические свойства, определить оптимальные условия и материалы для получения сорбентов с требуемыми хроматографическими параметрами.
  3. Провести хроматографическое испытание сорбентов, выбрать и оптимизировать протоколы очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим аффинным лигандом.
  4. Ввести различные хитинсвязывающие домены в структуру модельного рекомбинантного белка для определения наиболее подходящего варианта использования в качестве аффинного лиганда.
  5. Изучить возможности использования природных трехмерных хитиновых структур в качестве аффинных сорбентов.
  6. Исследовать влияние химической структуры аффинного сорбента на сорбцию рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим аффинным лигандом.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы были проанализированы и опробованы три стратегии получения аффинных сорбентов для очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим доменом. В соответствии с разработанными стратегиями были получены сорбенты на основе частично аморфизированного хитина, реацетилированного хитозана различной молекулярной массы, сорбенты в которых хитозан иммобилизован на инертной матрице и сорбенты на основе трехмерных хитиновых структур из скелетов морских губок. Проведены хроматографические испытания сорбентов для очистки рекомбинантных белков, сравнение полученных сорбентов по основным хроматографическим параметрам как между собой, так и с единственным коммерчески доступным сорбентом (New England Biolabs, США). Показано, что при оптимизации условий хроматографической очистки некоторые из полученных сорбентов не уступают по своим основным характеристикам коммерческому сорбенту при этом выигрывают в цене и простоте получения. Было исследовано влияние различных факторов (ионная сила подвижной фазы, степень сшивки сорбента, введение точечных мутаций в структуру хитинсвязывающего домена) на селективность и силу связывания аффинного лиганда с сорбентом. Впервые предложена возможность использования природных трехмерных хитиновых структур в качестве аффинных сорбентов для очистки рекомбинантных белков.

По итогам работы показано, что разработанные сорбенты имеют высокую селективность по отношению к хитинсвязывающей аффинной метке и достаточную емкость по белку для использования в сочетании с отработанными хроматографическими условиями при очистке рекомбинантных белков.

Апробация работы

Основные результаты, полученные в ходе данной работы были представлены автором на следующих международных и российских конференциях: XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008), конференция 14th international seminar and workshop «New aspects on chemistry and application of chitin and its derivatives» (Польша, 2009), Девятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008), конференция 9th International Conference of the European Chitin Society (Италия, 2009), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009), Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2010), Десятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010).





Личный вклад автора

Личный вклад автора заключался в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Часть работы, посвященная получению и определению физико-химических параметров хитиновых матриц из морских губок проводилась автором совместно с немецкими учеными в Техническом университете Дрездена (Институт биоаналитической химии, Дрезден, Германия) в рамках программы Erasmus Mundus Co-operational Programme between Russia and EU 2009.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных статей, в том числе 5 статей в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 80 страницах машинописного текста и включают 15 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 96 научных источников.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе работы был в соответствии с предложенными теоретическими стратегиями получен ряд аффинных сорбентов. Это сорбент на основе кристаллического хитина (Х-1), на основе реацетилированного хитозана (SLC) и сорбент, в котором низкомолекулярнй хитозан был иммобилизован на инертной матрице из поливинилового спирта (ДЕН-1). В случае сорбентов на основе хитозана был определен порог молекулярной массы полимера, котороый может быть использован для получения частиц сорбента с наибольшей емкостью по белку. Хроматографические испытания, в первую очередь, выявили недостаточную механическую прочность сорбентов SLC и Х-1, что не позволяло использовать их более двух хроматографических циклов. Для устранения этого недостатка была применена поперечная сшивка сорбента, при этом в качестве сшивающего агента был использован эпихлоргидрин, который может реагировать по гидроксильным группам полисахаридов. Такой выбор был обусловлен тем, что при использовании эпихлоргидрина в отличие от глутарового альдегида или глиоксаля для реакции сшивки не требуется наличия свободных аминогрупп полимера. Таким образом, обработку эпихлоргидрином можно проводить уже после реацетилирования хитозана, тем самым минимизируя вероятность нарушения селективности сорбента. Было получено три сорбента на основе хитина с различной расчетной степенью сшивки (Х-1.20Epy – 20%, Х-1.40Epy – 40% и Х-1.60Epy – 60%). Хроматографическая проверка показала, что во всех трех случаях механическая прочность повысилась в 4-5 раз (возможность использования до 10 хроматографических циклов очистки белка), однако с увеличением степени сшивки происходило снижение селективности сорбента вплоть до полной потери селективности в случае Х-1.60Epy (Таблица 1, Рис. 1). Сравнение эффективности сорбентов с различной степенью сшивки проводилось на примере очистки рекомбинантной оксидазы D-аминокислот (DAAO, Trigonopsis variabilis) со встроенным хитинсвязывающим доменом ChBDn.

Таблица 1. Сравнение эффективности сорбентов с различной степенью сшивки.

Сорбент Активность целевого белка в клеточном экстракте, Ед/Мг Активность белка в элюированных фракциях, Ед/Мг Степень очистки
Х-1 78 1011 13.00
Х-1.20Epy 62 800 12.9
Х-1.40Epy 71 632 8.90
Х-1.60Epy 75 36 0.48


Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.