WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 |

Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КУРЕК ДЕНИС ВЯЧЕСЛАВОВИЧ





Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами

03.01.06 Биотехнология (в том числе и бионанотехнологии)





АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва, 2011

Работа выполнена в лаборатории инженерии ферментов Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Варламов Валерий Петрович

кандидат химических наук

Лопатин Сергей Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Штильман Михаил Исаакович

доктор химических наук

Марквичева Елена Арнольдовна

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений

имени А. Н. Несмеянова РАН

Защита состоится «16» февраля 2011 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «14» января 2011 г.

Учёный секретарь

специализированного совета,

доктор физико-математических наук

Олейников В.А.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Рекомбинантные белки получают с использованием ДНК, в структуру которой введен ген другого организма, включая растения или животных, в том числе и человека. Важной особенностью получения рекомбинантных белков является высокая степень экспрессии целевого белка, иногда на несколько порядков превышающая уровень экспрессии в клетках родного организма. Последние два десятилетия одновременно с совершенствованием технологий получения рекомбинантных белков расширялись и области их применения в медицине и биотехнологии. Рекомбинантные белки уже широко используются в фармацевтике и медицине для лечения заболеваний, получения антител, иммуноферментного анализа или диагностики. Увеличивается и спектр использования рекомбинантных белков для научных целей. В первую очередь это получение новых ферментов с еще не известной структурой и свойствами в удобной системе экспрессии и дальнейшая очистка для последующих кристаллографических и физико-химических исследований.

В связи с расширяющимся спектром применения возникают и новые требования к качеству, универсальности методов и объемам получаемых рекомбинантных белков. С каждым годом увеличивается и разнообразие получаемых рекомбинантных белков, что требует разработки универсальных систем экспрессии и методов очистки. Использование таких универсальных систем позволит снизить стоимость получения и сделать более удобным сам процесс, часто являющийся лишь одной из стадий более масштабного исследования или производства. Кроме того, в случае применения в медицине или для исследования пространственного строения новых ферментов возникают высокие требования к степени очистки получаемых рекомбинантных белков, требующие совершенствования уже существующих или разработки новых методов постэкспрессионной очистки целевых белков.

В настоящий момент наиболее эффективным и самым широко распространенным методом очистки рекомбинантных белков является метод аффинной хроматографии. Принцип аффинной хроматографии базируется на уникальном сродстве различных молекулярных единиц друг к другу, например, фермент – ингибитор, фермент – субстрат, фермент – кофактор. Однако главным недостатком до определенного времени была узкая специфичность таких систем очистки – каждая система могла использоваться только для очистки лишь единичного белка. Разработанный в конце двадцатого века метод использования аффинных лигандов для очистки позволил преодолеть этот недостаток аффинной хроматографии, сделав ее универсальной. Аффинные лиганды представляют собой полипептидные вставки, встраиваемые в структуру целевого рекомбинантного белка с С- или N- конца, и имеющие высокое сродство к сорбенту. Использование аффинных лигандов позволяет производить одностадийную высокоэффективную очистку различных целевых белков из сложной смеси, используя при этом одну и ту же систему аффинной хроматографии. Более того в некоторых случаях использование аффинного лиганда может способствовать улучшению растворимости целевого белка. Появившаяся одной из первых и до сих пор широко применяемая система, использующая гексагистидиновый лиганд в сочетании с металлохелат аффинной хроматографией хотя и обладает целым рядом преимуществ, но и не является универсальной. Данная метка за счет своего малого размера практически не влияет на экспрессию или фолдинг целевого белка, а сам метод очистки является экономичным и удобным в рутинном использовании. Однако и такой вариант имеет ряд недостатков, таких как очистка нативных металлозависимых или богатых гистидинами балластных белков клетки продуцента помимо целевого белка. Поэтому на сегодняшний день существует целый ряд коммерческих аффинных лигандов, использующих различные варианты хроматографии и различающихся по своему размеру, свойствам и условиям очистки. Уже разработаны коммерчески доступные системы очистки, использующие субстратсвязывающие домены в качестве аффинных лигандов. Однако, например, в случае хитинсвязывающих доменов существует лишь одна дорогостоящая и не являющаяся оптимальной система очистки. Таким образом, на сегодняшний день не существует универсальной системы аффинной очистки рекомбинантных белков, и исследования в этой области продолжаются.



Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка новых аффинных сорбентов на основе хитина или хитозана для использования их в сочетании с хитинсвязывающим аффинным лигандом для очистки рекомбинантных белков; подбор и оптимизация хроматографических параметров метода для получения наиболее эффективных результатов; исследование условий и особенностей сорбции модельных рекомбинантных белков на полученных сорбентах.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

  1. Синтезировать новые аффинные сорбенты на основе хитина или хитозана.
  2. Изучить их хроматографические и физические свойства, определить оптимальные условия и материалы для получения сорбентов с требуемыми хроматографическими параметрами.
  3. Провести хроматографическое испытание сорбентов, выбрать и оптимизировать протоколы очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим аффинным лигандом.
  4. Ввести различны