WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Свободнорадикальные процессы в крови крыс при умеренной гипотермии и введении даларгина

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

ОМАРОВА лейла таджибовна

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ

В КРОВИ КРЫС ПРИ УМЕРЕННОЙ ГИПОТЕРМИИ

И ВВЕДЕНИИ ДАЛАРГИНА

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2013

Работа выполнена на кафедре химии Дагестанского государственного

технического университета и кафедре биохимии и биофизики

Дагестанского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Кличханов Нисред Кадирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чиков Владимир Иванович (ФГБУН «Ка- занский институт биохимии и биофизики» Каз НЦ РАН, зав. лабораторией)

кандидат биололгических наук, Ганеева Лилия Ахатовна (лаборатория биохимии нуклеиновых кислот института фундамен- дальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федераль- ный университет, научный сотрудник.)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ

Защита диссертации состоится 31 октября 2013 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудитория № 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан «______»_______________ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процессы метаболизма кислорода в организме связаны с образованием активных форм кислорода (АФК), обладающих выраженной реакционной способностью. АФК образуются в результате нормально протекающих процессов в организме и выполняют определенную биологическую функцию. Действие АФК в организме фактически направлено на 3 типа клеточных мишеней: белки, нуклеиновые кислоты и липиды. В норме они активно участвуют в их метаболизме, а при патологических состояниях – в их окислительной деструкции (Меньщикова и др., Окислительный стресс: Прооксиданты и антиоксиданты. – М.: Фирма «Слово». 2006. 554 с.; Magder. Critical Care. 2006. V. 10, N. 1. P. 208-216.).

В настоящее время общую и локальную гипотермию используют в медицинской практике, главным образом, в целях снижения кислородных запросов тканей и устранения ишемических и гипоксических явлений (Polderman, Crit. care Med. 2009. V. 37(7). P. S186-S202.). В то же время для ненаркотизированных животных гипотермия представляет определенную опасность, связанную с активацией свободнорадикальных процессов (СРП) в тканях (Дорохина, Зинчук, Bесцi НАН РБ. Сер. бiял. нав. 2000. № 4. С. 87–90; Кличханов и др. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2001. Т.131, № 3. С. 281-284.; Erecinska et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2003. V. 23. P.513-550; Ахалая и др., Бюл. эксперим. биол. и мед. 2006. Т. 141, № 1. С. 31-34.). Свободнорадикальный гомеостаз клеток и тканей обеспечивается согласованием между ферментативными и неферментативными системами генерации АФК с одной стороны, и системами их элиминации – с другой. Гипотермия может смещать баланс в сторону избыточной генерации свободных радикалов и приводить к дефициту антиоксидантов (Zinchuk et al. J. Thermal Biology. 2002. V. 27. P. 345-352), что, в свою очередь, окажет существенное влияние на химический состав биологических мембран, их ультраструктурную организацию, проницаемость, активность мембранных ферментов. В связи с этим вопрос о возможности регуляторного влияния на СРП в тканях при гипотермических состояниях остается актуальным.

Антистрессорные вещества понижают интенсивность СРП и оказывают протекторное действие на мембраны. К таким веществам относится ряд пептидов, в частности синтетический гексапептид даларгин. Даларгин (Тир-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг) – синтетический аналог нейропептида лей-энкефалина, содержащий ключевую последовательность аминокислот всех опиоидов (Тир-Гли-Гли-Фен) (Лишманов, Маслов. Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1994. 352 с.). Показано, что предварительное внутрибрюшинное введение даларгина снижает степень активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) в миокарде крыс при ишемии и стрессовых воздействиях, а также в печени при холестазе (Лишманов и др. Успехи физиол. наук. 1997. Т. 28, № 1. С. 75-96; Реброва и др. Биомедицинская химия.2005. Т. 51. С. 177-184). Внутривенно введенный даларгин (100 мкг/кг) предотвращал стимулируемую оксидантами (Fe2+-аскорбат) активацию процессов ПОЛ в изолированном сердце (Лишманов и др. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1992. Т. 64, № 11. С. 468-470). Использование даларгина в комплексе общей анестезии ограничивало активацию ПОЛ в крови в реперфузионном периоде после аортокоронарного шунтирования (Князькова и др. Патология кровообращения и кардиохирургия. – 2007. № 4. С. 21-26.). Предварительное введение даларгина (100 мкг/кг) предотвращало активацию ПОЛ в крови и нарушение структурно-функциональных свойств эритроцитов при гипотермии (Эмирбеков и др., Изв. вузов Сев.-Кав. рег. Естеств. науки. Спецвыпуск. 2005. С. 63-66.). Таким образом, при стрессорных и патологических состояниях введение даларгина предотвращает активацию СРП в тканях. Однако механизмы антиоксидантного действия даларгина пока еще полностью не установлены.



Цель исследования – изучить пути активации свободнорадикальных процессов в крови крыс при острой кратковременной умеренной гипотермии, а также механизмы их коррекции даларгином.

Задачи исследования:

1. Определить уровень гормонов гипоталамо-гипофизарно-надпочеч-никовой и тиреоидной систем в крови в условиях раздельного и сочетанного применения гипотермии и даларгина.

2. Провести сравнительный анализ интенсивности процессов ПОЛ в различных тканях до и после введения даларгина.

3. Изучить изменение уровня мочевой кислоты и метаболитов оксида азота в плазме крови при гипотермии на фоне введения даларгина.

4. Выявить действие даларгина на интенсивность окислительной модификации липидов и белков плазмы крови и мембран эритроцитов при умеренной гипотермии.

5. Оценить уровень прооксидантов и активность компонентов антиоксидантной защиты плазмы крови и эритроцитов при гипотермии и введении даларгина.

6. Показать степень перекисного, кислотного и внутрисосудистого гемолиза эритроцитов при гипотермии до и после введения даларгина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Умеренная гипотермия сопровождается развитием холодового стресса, что приводит к стимуляции процессов образование АФК, окислительной модификации липидов и белков плазмы крови и мембран эритроцитов. Окислительные повреждения мембран эритроцитов при гипотермии приводят к их гемолизу.

2. Введение животным перед охлаждением даларгина предупреждает развитие холодового стресса, снижает стимулирующее действие гипотермии на интенсивность свободнорадикальных процессов в крови, защищает эритроциты от окислительного повреждения.

Научная новизна. Показано, что умеренная гипотермия приводит к гиперстимуляции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы. Впервые установлено, что умеренная гипотермия стимулирует образование активных форм кислорода, повышение уровня прооксидантов в плазме, снижение содержания восстановленного глутатиона (GSH) в эритроцитах, что способствует развитию окислительного стресса в крови. Окислительные повреждения белков и липидов мембран эритроцитов при гипотермии приводят к ускорению внутрисосудистого гемолиза эритроцитов.

Установлено, что даларгин снижает интенсивность ПОЛ в различных тканях и этот эффект зависит от времени внутрибрюшинного введения пептида. Впервые установлено, что при низких концентрациях (100 мкг/кг.) даларгин не проявляет непосредственное антиоксидантное действие. Впервые показано, что введение даларгина предотвращает развитие холодового стресса у крыс при умеренной гипотермии. Даларгин в условиях гипотермии предотвращает рост уровня АФК в крови, степень окислительной модификации липидов и белков плазмы крови и мембран эритроцитов, падение уровня GSH в эритроцитах. Впервые показано, что даларгин предотвращает повышение уровня прооксидантов в крови при гипотермии. Защита мембран от окислительного повреждения даларгином предотвращает внутрисосудистый гемолиз эритроцитов при гипотермии.

Теоретическая и практическая значимость. Обнаруженные в работе закономерности развития свободнорадикальных процессов при умеренной гипотермии могут быть использованы для построения моделей взаимосвязи между интенсивностью энергетического обмена и генерацией свободных радикалов, а также для построения теории эволюции адаптивных механизмов, контролирующих СРП в клетках. Решение указанных теоретических проблем позволит разработать меры по предотвращению вспышек СРП при существенных изменениях интенсивности метаболических процессов в организме.

Результаты исследования расширяют представления о клеточных механизмах регуляции лигандами опиоидных рецепторов СРП. Полученные в данной работе факты, раскрывающие механизмы реализации антистрессорного, «антиоксидантного» и мембранностабилизирующего свойств даларгина (выпускаемого рядом фармацевтических фирм в качестве лекарственного препарата) в условиях гипотермии, открывают новые перспективы его практического применения в медицине с целью управления адаптационными реакциями организма.

Внедрение результатов работы в практику. Основные результаты работы внедрены в учебный процесс в виде методических разработок для проведения практических и семинарских занятий на кафедре биохимии и биофизики Дагестанского государственного университета и включены в спецкурс «Свободнорадикальные процессы в биологических системах».





Апробация работы. Результаты настоящего исследования были представлены и обсуждены на II Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2008), XXIX и XXX итоговых научно-технических конференциях преподавателей, сотрудников, аспирантов и студентов ДГТУ (Махачкала, 2008, 2009), 12-й, 14-й Международных школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (г. Пущино, 2008, 2010), Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптаций растений и животных» (г. Махачкала, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), на расширенном заседании кафедры технологии приготовления пищи ДГТУ и кафедры биохимии и биофизики ДГУ (2012). По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы (239 источника). Диссертационная работа содержит 3 рисунка и 17 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполнены на 226 крысах-самцах линии Вистар, массой 200-220 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Эксперимент проводился в соответствии с требованиями нормативных правовых актов, регламентирующих выполнение исследований по безопасности и эффективности фармакологических веществ в Р Ф (Приказ МЗ РФ «Об утверждении правил лабораторной практики» № 267 от 19.06.2003 г.) и международных правил правовых и этических норм использования животных.

Гипотермию вызывали наружным охлаждением животных в плексигласовых камерах. Температуру тела равномерно снижали от 38 до 30 ° С за 28-30 мин.

Фармакопейный препарат даларгин (НПО «Микроген») вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг. массы тела за 30 мин. до декапитации (контроль) или за 30 мин.до начала снижения температуры тела крыс. Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора. Дозы и сроки инъекции даларгина подобраны, основываясь на биохимических и физиологических эффектах пептида (Лишманов, Маслов, Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 1994. 352 с.).

Из головного мозга, печени, миокарда и скелетных мышц готовили 10% гомогенаты в 0,1 М трис-HCl буфере рН 7,4. Гомогенаты тканей центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Постядерные гомогенаты использовали в опыты. Тени эритроцитов получали после гипоосмотического гемолиза (Казенов и др., Биохимия. 1984. Т. 49, № 7. С. 1089-1095.).

Исследование содержания адренокортикотропного гормона (АКТГ), кортизола, тироксина в плазме крови проводилось радиоиммунологическим методом с использованием стандартных тест-наборов фирмы «Immunothech» (США) на гамма-счетчике «Микро-800» (США).

Интенсивность образования АФК оценивали по содержанию мочевой кислоты и оксида азота в плазме крови. Содержание мочевой кислоты в плазме крови определяли энзиматическим методом «Ольвекс Диагностикум». Уровень продукции оксида азота оценивали по содержанию его стабильных конечных метаболитов – нитратов и нитритов в плазме крови. Предварительно нитраты восстанавливали металлическим кадмием до нитритов, концентрации которых определяли по цветной реакции с реактивом Грисса (Емченко и др. Клин. лаб. диагностика. 1994. №6. С.19-20.).

Об интенсивности ПОЛ в крови судили по содержанию первичных (диеновых конъюгатов, ДК) и вторичных (малоновый диальдегид, МДА) продуктов пероксидации липидов. Содержание ДК в гептановых и изопропанольных экстрактах крови определяли по поглощению в ультрафиолетовой области спектра (Волчегорский и др. Вопр. мед. хим. 1994. № 2. С. 28-32.). Количественное определение МДА в плазме крови и эритроцитах проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей оценивали по содержанию МДА (Лемешко и др. Укр. биохим. журн. – 1987. Т. 59. С. 50-57.). При этом измерено исходное содержание МДА и его накопление в гомогенатах тканей за 30 минут в присутствии системы Fe2+-аскорбат.

Об интенсивности окислительной модификации белков (ОМБ) плазмы крови и мембран эритроцитов судили по содержанию в них карбонильных групп, реагирующих с 2,4-динитрофенолгидразином (Дубинина и др., Жизнь и смерть, созидание и разрушение. С.-Петербург, 2006. 400 с.). Содержание тиоловых групп в белках плазмы крови и мембран эритроцитов определяли методом амперометрического титрования (Соколовский.Лаб. дело. 1962. № 8. С. 3-6.), а дисульфидных связей – методом обратного титрования (Соколовский и др. Лаб. дело. 1977. № 1. С. 26-28.). Содержание среднемолекулярных пептидов (СМП) в плазме крови определяли по методу В.С. Осиповича и З.А. Тупиковой (1987). Общее содержание железа в сыворотке крови крыс определяли на биохимическом анализаторе «Ультра 906» фирмы «Коне» (Финляндия), с использованием тест-набора фирмы «Коне».



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.