WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Апоптоз-модулирующие эффекты биназы в фагоцитирующих клетках

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Миронов Владислав Алексеевич

АПОПТОЗ-МОДУЛИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ БИНАЗЫ В ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТКАХ

03.01.04 – Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань-2013

Работа выполнена на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета

Научные руководители: кандидат химических наук, старший научный

сотрудник Калачева Наталия Васильевна

доктор медицинских наук, профессор

Черепнев Георгий Валентинович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Мустафин Ильшат Ганиевич

(ГОУ ВПО «Казанский государственный

медицинский университет», г.Казань)

кандидат биологических наук, врач КЛД высшей

категории Саттарова Лилия Ирековна

(Межрегиональный клинико-диагностический

центр, г.Казань)

Ведущая организация: ФБУН «Казанский научно-исследовательский

Институт эпидемиологии и микробиологии»

Защита диссертации состоится «____» мая 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском федеральном университете.
Автореферат разослан «____» апреля 2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук З. И. Абрамова

Актуальность проблемы. В течение последнего десятилетия регуляция и медикаментозный контроль апоптоза становятся областью пристального внимания биологов и клиницистов [Сaputo et al.,2012; Scatena, 2012; Sreedhаr et al.,2004]. Восстановление чувствительности клеток к индукции апоптоза имеет терапевтическое значение при неоплазиях, лимфопролиферации и аутоиммунных болезнях. Напротив, если ведущим компонентом патологического процесса является клеточная гибель (ишемия тканей, нейродегенерация, депрессия гемопоэза, ВИЧ-инфекция, ожоговая болезнь и др.), то патогенетически обосновано подавление апоптоза. Учитывая социальное значение апоптоз-зависимых заболеваний, поиск соединений с направленным воздействием на программированную клеточную гибель является актуальной проблемой современной медико-биологической науки [Vasanth Raj et al., 2010; Pennа et al.,2009; Chandrashekhar et al, 2001].

В настоящей работе исследуются апоптоз-модулирующие эффекты биназы в фагоцитирующих клетках. Фагоцитирующие клетки крови – гетерогенная популяция, опосредующая антиинфекционную резистентность в рамках естественного иммунитета (гранулоциты) и адаптивного иммунитета (процессинг и представление антигенов моноцитами) [Ярилин, 2010]. Накоплено много данных об участии моноцитов и гранулоцитов в развитии соматических заболеваний, например, ишемической болезни сердца и атеросклероза, а также в формировании злокачественных новообразований [Granot et al., 2011., Garlichs et al., 2004; Libby et al., 2002]. При этом в ряде работ отмечается положительная или отрицательная корреляция апоптотической гибели фагоцитирующих клеток с течением заболевания [Нестеренко, 2010; Sica et al., 2007]. Кроме того, фагоциты генерируют активные формы кислорода (АФК), и в случае нарушения своих функций становятся источником повреждения и гибели клеток [Morel et al., 1991]. В связи с этим работы по изучению соединений, способных модулировать апоптоз и функциональную активность фагоцитов, считаются одними из приоритетных в области медицинской биологии.

Поиск регуляторов апоптоза имеет предпочтительные шансы на успех в тех группах веществ, представители которых обладают широким спектром биологических эффектов в различных тканях-мишенях. В этом аспекте заслуживают внимания рибонуклеазы. На сегодняшний день известен целый ряд эффектов этих ферментов (противовирусный, противоопухолевый, апоптогенный, иммуносупрессорный и другие), в связи с чем рибонуклеазы привлекают к себе внимание как потенциальные лекарственные средства нового поколения [Fang et al., 2011; Ardelt et al., 2009; Makarov et al., 2008; Edelweiss et al., 2008; Ильинская и др., 2005; Spaletti-Cernia et al., 2004;].

Объект настоящего исследования РНКаза Bacillus intermedius (биназа). Выбор биназы для изучения потенциальной апоптоз-модулирующей активности в клетках крови не случаен. Он обусловлен тем, что биназа принадлежит к одному из наиболее хорошо изученных микробных ферментов и обладает способностью избирательно подавлять рост некоторых линий онкотрансформированных клеток, переводя их на путь апоптоза. Молекулярные механизмы селективного апоптогенного действия биназы на опухолевые клетки интенсивно изучаются [Mitkevich et al., 2013; Кабрера Фуентес и др., 2010; Зеленихин и др., 2005]. Кроме того, биназа обладает комплексом биологических эффектов на клеточном уровне, «триггерные» механизмы которых локализованы в мембране клеток. К ним относятся: индукция пролиферации, стимуляция дифференцировки Т-лимфоцитов, метаболическая активация нейтрофилов и др. [Куриненко, 1991]. Эти феномены не зависят от каталитической активности фермента. Несмотря на обилие экспериментальных работ, влияние биназы на апоптоз и функциональную активность фагоцитирующих клеток крови человека ex vivo не изучено.



Цель работы - анализ апоптоз-модулирующих эффектов биназы в фагоцитирующих клетках венозной крови человека и перитонеальных макрофагах крысы.

Задачи работы

  1. Исследовать влияние биназы на развитие спонтанного и пероксид-индуцированного апоптоза в субпопуляциях лейкоцитов венозной крови человека.
  1. Изучить действие биназы на апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов крысы в условиях Н2О2-индуцированного окислительного стресса.
  2. Оценить влияние биназы на интенсивность перекисного окисления липидов перитонеальных макрофагов крысы.
  3. Охарактеризовать действие биназы на параметры основного фазового перехода дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) гель-жидкий кристалл.
  4. Исследовать влияние биназы на индукцию активных форм кислорода (АФК) и форболмиристатацетат (ФМА)-индуцированный апоптоз в моноцитах и гранулоцитах крови человека.
  5. Сравнить проапоптогенные эффекты мономера и химически «сшитого» димера биназы.

Научная новизна. Впервые установлено, что биназа избирательно модифицирует спонтанный и пероксид-индуцированный апоптоз моноцитов крови человека и не влияет на программированную клеточную гибель лимфоцитов и гранулоцитов. В условиях окислительного стресса биназа в зависимости от концентрации увеличивает жизнеспособность моноцитов и тормозит переход клеток из стадии раннего в стадию позднего апоптоза.

Впервые продемонстрировано, что биназа избирательно и дифференцированно действует на E. coli- и ФМА-зависимый окислительный взрыв в гранулоцитах и не влияет на эти процессы в моноцитах.

Выявлен синергизм действия биназы с форболмиристатацетатом в гранулоцитах и моноцитах крови человека в модели ФМА-индуцированного апоптоза.

Дальнейшая идентификация молекулярных механизмов цитопротекторного и апоптоз-модулирующего эффектов биназы в мононуклеарных фагоцитах позволит приблизиться к пониманию избирательности действия биназы на клетки, в том числе и опухолевые, что в итоге будет способствовать разработке подходов к управлению программированной гибелью клеток.

Практическая значимость. Обнаруженные протекторный и апоптоз-модулирующий эффекты биназы в фагоцитирующих клетках открывают новые перспективы её применения и позволяют рассматривать биназу в качестве потенциального биофармацевтического модулятора апоптоза фагоцитов при воспалении, аутоиммунных заболеваниях и иммунодефицитах.

Полученный в работе химически «сшитый» димер биназы, сохраняющий до 50% удельной активности и обладающий более выраженным проапоптогенным действием на клетки по сравнению с мономером, представляет интерес как потенциальный противоопухолевый препарат.

Положения, выносимые на защиту

  1. Биназа избирательно модулирует апоптоз и индукцию АФК в фагоцитирующих клетках периферической крови человека. Конечный эффект биназы зависит от субпопуляционной принадлежности клеток-мишеней, а также от природы используемых индукторов апоптоза и АФК.
  2. Биназа проявляет протекторный и апоптоз-модулирующий эффекты в моноцитах человека в модели пероксид-индуцированного окислительного стресса.
  3. Мембранотропность биназы - один из значимых факторов, определяющих механизмы ее цитопротекторного и апоптоз-модулирующего эффектов.

Апробация работы

Основные результаты диссертации были доложены на «First Interuniversity Conference on Modern Biology» (Казань, 2008), «XIV International Conference “Microbial Enzymes in Biotechnology and Medicine» (Казань, 2009), XIV Международной научной школе «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия» (Казань, 2010), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), Международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2012), а также на итоговых конференциях КФУ (2010-2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132 страницах текста и содержит 5 таблиц и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использована гуанилспецифичная РНКаза Bacillus intermedius 7Р дикого типа - биназа (КФ 3.1.27.3), катионный белок с молекулярной массой 12.3 кДа, состоит из 109 аминокислотных остатков [Aphanasenko et al, 1979]. Определена пространственная структура биназы [Reibarkh et al., 1998]. Электрофоретически гомогенный препарат биназы получали по методике, описанной в работе [Голубенко и др., 1979].

Лейкоциты выделяли из венозной крови здоровых доноров добровольцев, от которых было получено информированное согласие. Гепаринизированную венозную кровь отстаивали в течение 30 минут при 37оС, отбирали слой сыворотки с лейкоцитами и отмывали клетки центрифугированием (200 g, 10 мин). Полученный осадок лейкоцитов ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 106 клеток/мл и раскапывали по 250 мкл в пробирки для проточной цитометрии (Falcon 352054, BD).





Работу с крысами проводили с соблюдением принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Белых беспородных крыс забивали декапитацией (с применением эфирного наркоза). Перитонеальные макрофаги выделяли из перитонеальных смывов, полученных путем введения животным в брюшную полость холодного физиологического раствора. Клетки промывали 0,9% раствором NaCl, суспензировали в среде PRMI («Sigma», США), далее разводили до концентрации 106 клеток/мл и использовали в экспериментах в виде суспензии и монослойной культуры на покровных стеклах.

Индукцию апоптоза в клетках осуществляли в модели окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода. Концентрацию пероксида водорода подбирали в зависимости от экспериментальной модели. Наряду с пероксидом водорода в качестве индуктора апоптоза использовали ФМА.

Цитометрический анализ субпопуляций лейкоцитов выполняли на проточном лазерном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA), оснащенном двумя лазерами с длиной волны 488 нм и 635 нм.

Экспрессию фосфатидилсерина (ФС) и проницаемость плазматической мембраны на уровне отдельной клетки оценивали по модифицированному протоколу [Laakko et al., 2002]. В опытные пробы вносили раствор биназы в фосфатно-солевом буфере (конечная концентрация 400 и 40 мкг/мл), инкубировали 30 мин и добавляли пероксид водорода в конечной концентрации 3 мМ (или ФМА в конечной концентрация 10-7 М). В контрольные пробы вместо биназы, пероксида водорода (или ФМА) вносили фосфатно-солевой буфер в эквивалентном объеме. Клетки инкубировали 3 часа в СО2-инкубаторе при 37 °C и 100% влажности. В пробы (опытные и контрольные) за 10 мин перед цитометрическим анализом вносили ФС-связывающий флуорохром мероцианин-540 (МС-540) в конечной концентрации 0,2 мкг/мл. Для оценки проницаемости плазматической мембраны в клеточную суспензию одновременно с MC-540 вносили TO-PRO-3-йодид в конечной концентрации 0,2 M. МС540 связывается с остатками фосфатидилсерина, экспонированного на мембране апоптозных клеток. ДНК-тропный флуорохром TO-PRO-3 через поврежденную цитоплазматическую мембрану проникает внутрь клетки и окрашивает ДНК. Лимфоидную, моноцитарную и гранулоцитарную субпопуляции выделяли по показателям прямого (FSC, диаметр клетки) и бокового (SSC, гранулярность клетки) светорассеяния.

После исключения дебриса и выделения лимфоидного, моноцитарного и гранулоцитарного регионов, подсчитывали долю: интактных клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(-)]; клеток на ранней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(-)]; клеток на поздней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(+)]; некротических клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(+)].

Генерацию АФК в моноцитах и гранулоцитах измеряли методом проточной цитометрии с использованием тест-набора Phagoburst® (OPREGEN Pharma, Germany) по инструкции производителя. Для индукции АФК применяли лиофильно высушенную опсонизированную культуру бактерий E. coli и форбол-12-миристат-13-ацетат. Внутриклеточную продукцию АФК регистрировали при окраске дигидрородамином 123 (DHR123).

В опытные пробы с клеточной суспензией вносили раствор биназы в фосфатно-солевом буфере (конечная концентрация 400 и 40 мкг/мл) и 20 мкл рабочего раствора DHR123. Под действием АФК DHR123 превращался в родамин 123 (Rh123), флуоресценцию которого регистрировали на проточном цитофлуориметре.

Идентификацию жизнеспособных, некротических и апоптотических макрофагов осуществляли методом световой микроскопии. Некротические и апоптотические клетки дифференцировали по характерным морфологическим признакам [Debby et al., 2004] после окрашивания по Романовскому-Гимза. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью красителя трипанового синего. Анализировали несколько полей зрения на каждом стекле и рассчитывали относительное содержание каждой клеточной популяции.

Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) регистрировали на программируемом биохемилюминометре БХЛ-6 (Нижний Новгород, Россия) по стандартной методике [Данилова, 2003]. Измеряли следующие показатели: светосумму (S) хемилюминесценции (ХЛ), интенсивность максимальной вспышки (Imax) и тангенс угла падения кинетической кривой (tg).

Калориметрические измерения выполняли на микрокалориметре МicroCal VP-DSC Microcalorimeter (Tby, Sweden). Были исследованы температура и энтальпия основного фазового перехода DPPC гель-жидкий кристалл и кривые плавления липида в присутствие 100 и 200 мкг/мл биназы. Термограммы были получены при нагревании и охлаждении от 5 до 45С. Обработку данных производили с помощью программного обеспечения MicroCal Origin.

Димер получали посредством «сшивания» молекул биназы диметилсуберимидатом [Wang et al.,1976].

Визуализацию клеточной поверхности макрофагов проводили в открытой камере при комнатной температуре в полуконтактном режиме на атомном силовом микроскопе (АСМ) Solver P47H (ЗАО «НТ-МДТ»), сканер 50 мкм. Использовали кремниевые кантилеверы NSG11 (ЗАО «НТ-МДТ») с радиусом кривизны острия не менее 10 нм. Примененялись 3 методики сканирования: постоянной амплитуды, фазового контраста и сигнала рассогласования. Рабочая амплитуда колебаний кантилевера 30—50 нм.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.