WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птиц

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Полешко Андрей Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА МОДЕЛИ ВИРУСА САРКОМЫ ПТИЦ

03.00.04 – биохимия

03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Новосибирский государственный университет

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Покровский Андрей Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна

кандидат биологических наук Чересиз Сергей Владимирович

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «___» декабря 2008 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова 2, 630117, тел: (383) 333-54-81.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАН.

Автореферат разослан «___» ноября 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. Г.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клеточные эпигенетические механизмы, включающие РНК-интерференцию, метилирование ДНК и модификации гистонов, участвуют в наследуемой регуляции экспрессии генов без изменения последовательностей ДНК. Исследования последних лет показали, что нарушение эпигенетической регуляции ряда генов приводит ко многим серьезным патологиям, включая онкологические заболевания, анемию, задержки умственного развития и др. Понимание причин возникновения таких заболеваний и поиск методов их лечения основаны на исследованиях биохимических механизмов эпигенетической регуляции, выявлению ферментов, ответственных за реактивацию, и разработке новых методов эпигенетической терапии (Egger G. et al, 2004).

Кроме патологий, вызываемых нарушениями экспрессии клеточных генов, существует ряд инфекционных заболеваний, лечение которых тесно связано с эпигенетической регуляцией. Особенностью ретровирусных инфекций является наличие латентного резервуара инфицированных клеток, препятствующего элиминированию вируса из организма и полному излечению от ретровирусной инфекции. Исследование механизмов эпигенетического контроля экспрессии ретровирусных генов необходимо для поиска новых подходов по реактивации инфицированных клеток, несущих латентный ретровирус. Используемые в настоящее время методы лечения ретровирусных инфекций основаны на высоко активной антиретровирусной терапии с применением комбинаций различных препаратов, ингибиторов вирусных белков и ферментов. Недостатками такого лечения являются: 1) сохранение в организме резервуара инфицированных клеток (несущих способную к реактивации латентную форму ретровируса); 2) длительная антивирусная терапия осложняется возможностью появления мутантных форм вируса, устойчивых к большинству используемых лекарственных препаратов. Наиболее перспективным направлением в лечении ретровирусных инфекций является применение антиретровирусной терапии совместно с активацией инфицированных клеток, несущих эпигенетически-молчащий интегрированный провирус, и составляющих вирусный резервуар. Такой подход позволяет элиминировать вирус из организма, за счет предотвращения ретровирусной репликации и удаления резервуара инфицированных клеток, в том числе несущих латентный ретровирус (Geeraert L. et al, 2008).

Помимо проблемы латентных ретровирусных инфекций, изучение механизмов эпигенетического молчания ретровирусных генов является исключительно важным для генной терапии с применением векторов на основе ретровирусов. Поддержание продолжительной экспрессии «терапевтического» гена, доставленного ретровирусным вектором и интегрированного в геном клетки-мишени, невозможно без понимания основных клеточных механизмов эпигенетической регуляции.

Целью настоящей работы являлось создание модели, на основе клеточной линии HeLa, несущей интегрированный ретровирусный вектор, и последующее изучение механизмов эпигенетического контроля экспрессии ретровирусных генов.

В задачи настоящего исследования входило:

  • Получить субпопуляцию клеток HeLa, несущих транскрипционно-молчащий интегрированный вектор на основе вируса саркомы птиц, кодирующий репортерный GFP ген. Оценить возможность использования данной клеточной линии для изучения механизмов эпигенетического контроля ретровирусов.
  • Проверить возможность использования методов РНК-интерференции для изучения эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов. Оценить эффективность и специфичность нокдауна генов-мишеней посредством трансфекции клеток миРНК.
  • Создать систему скрининга библиотек миРНК с высокой пропускной способностью для поиска клеточных генов, участвующих в поддержании эпигенетического молчания.
  • Осуществить скрининг библиотеки миРНК, содержащей потенциальные эпигенетические регуляторы, для определения клеточных генов, участвующих в поддержание эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов.
  • На основе полученных данных создать модель эпигенетической регуляции экспрессии генов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Исследования последних лет показали, что нарушения механизмов эпигенетического контроля экспрессии генов приводит к различным патологиям и заболеваниям, и кроме того затрудняет лечение ряда инфекционных заболеваний вызываемых ретровирусами. Поиск новых подходов для лечения этих заболеваний осложняется за счет отсутствия достаточных знаний о механизмах клеточного эпигенетического контроля и причинах, вызывающих его нарушения, а так же возможных методах эпигенетической терапии.



На сегодняшний день для лечения ретровирусных инфекций, таких как вирус иммунодефицита человека, наиболее перспективными методами является применение антиретровирусной терапии совместно с активацией резервуара инфицированных клеток, несущих латентный ретровирус. Для реактивации латентных форм ретровирусов применяются ингибиторы гистоновых деацетилаз и ДНК метилтрансфераз. Данные препараты имеют высокую активность, но также и высокую токсичность для клеток, что не позволяет им пройти клинические испытания и быть использованными в антиретровирусной терапии. Таким образом, исследование механизмов эпигенетического контроля ретровирусных генов совместно с поиском новых групп соединений, способных к реактивации латентных ретровирусов и обладающих низкой токсичностью, являются особенно актуальным.

Положения, выносимые на защиту:

  • Выделенная из клеточной линии HeLa, субпопуляция клеток HeLa ТИ, несущая транскрипционно-молчащий интегрированный ретровирусный вектор на основе вируса саркомы птиц, содержащий GFP репортерный ген под контролем различных промоторов, может быть использована как модель для изучения механизмов эпигенетического контроля экспрессии генов.
  • Методы РНК-интерференции могут быть применены для поиска и определения клеточных генов участвующих в поддержании эпигенетического молчания ретровирусных генов. Продукты экспрессии генов HDAC1, DAXX и HP1, участвуют в поддержании эпигенетического молчания. Нокдаун этих генов приводит к реактивации ретровирусного репортерного гена.
  • Клеточные гены SETDB1, CHAF1A, TRIM24, TRIM33, RAD21, PBRM1, ZMYND8, MBD1, MBD3, DNMT3a, RING1, PHC2, FBXL11, Suv420H2, JMJD2A, выявленные в ходе скрининга библиотеки миРНК, участвуют в эпигенетическом контроле экспрессии генов. На основе полученных данных предложена модель эпигенетического контроля ретровирусов.

Апробация работы и публикации. Результаты работ были представлены на международных конференциях: «33rd Retroviruses meeting» (Колд Сприн Харбор, США, 2008), «Международная Студенческая Конференция XXXVIII» (Новосибирск, Россия. 2008), «12th Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2007), «32nd Retroviruses meeting» (Колд Сприн Харбор, США, 2007), «11th Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2006). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 31 рисунок, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а так же списка литературы (240 источников).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Библиотека миРНК. В ходе исследований была использована библиотека миРНК «Epigenetics Set» (QIAGEN, США). Библиотека содержала 200 генов (две независимые миРНК против каждого гена-мишени).

Культивирование клеток, выделение субпопуляции HeLa ТИ клеток. Популяция человеческих эпителиальных клеток HeLa была культивирована в культуральной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0.1 мг/мл стрептомицина и 1х фангазон. Клетки инкубировались при 37оС в присутствии 5% СО2. Сортировка клеток проводилась на проточном цитофлюориметре Becton Dickinson FACS-VantageSE.

Анализ количества GFP-положительных клеток. Измерение уровня экспрессии GFP проводилось на проточном цитофлюорометре Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson, США) и Guava EasyCyte (Guava Technologies, США). Полученные данные обрабатывались при помощи программ FlowJo (Tree Star Inc, США) и CytoSoft (Guava Technologies, США).

РНК-интерференция. В качестве трансфекционного реагента для трансфекции миРНК в клеточную линию HeLa использовался реагент DharmaFECT 1 (Dharmacon, США). Трансфекция клеток проводилась согласно протоколу компании производителя. Спустя 96 часов после начала трансфекции количество GFP-положительных клеток измерялось методами проточной цитофлюорометрии. Измерение эффективности нокдауна методом РНК-интерференции на уровне мРНК и белка проводилось после 48 и 72 часов с момента начала трансфекции, соответственно.

Скрининг библиотеки миРНК. Скрининг был осуществлен с использованием трансфекционного реагента DharmaFECT 1, согласно протоколу компании изготовителя, оптимизированному для использования с 96-луночными плашками. Объем трансфекционной смеси в каждой лунке составлял 100 мкл, итоговая концентрация миРНК 50 нМ, количество клеток в лунке 5000. Плашки инкубировались при 37оС с 5% CO2 в течении 48 часов, затем трансфекционная смесь заменялась на стандартную ростовую среду. Через 96 часов после начала трансфекции количество GFP-положительных клеток определялось с помощью методов проточной цитофлюорометрии. В качестве контролей использовались миРНК против HDAC1 и GAPDH, как положительный и отрицательный контроль, соответственно.





РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и анализ субпопуляции клеток HeLa несущих молчащий ретровирус, кодирующий репортерный GFP ген

Популяция HeLa ТИ клеток, несущих молчащий ретровирусный GFP репортерный ген, была получена, как показано на Рисунке 1. Популяция человеческих HeLa клеток была инфицирована ретровирусным вектором, несущим GFP репортерный ген. После инфицирования клетки были отсортированы на GFP-отрицательный фенотип. Полученная клеточная субпопуляция содержала неинфицированные клетки и клетки с эпигенетически-молчащим репортерным GFP геном. После сортировки, субпопуляция GFP-негативных клеток была обработана ингибитором гистоновых деацетилаз – трихостатином А (TSA). Обработка проводилась с концентрацией TSA 500 нМ в течение 24 часов. Обработка клеток приводила к гиперацетилированию гистонов и активации молчащих генов, в том числе репортерного GFP гена. Через 48 часов после начала обработки клетки были отсортированы на GFP-положительный фенотип. Полученная клеточная субпопуляция содержала инфицированные клетки, с ранее молчащим GFP-репортерным геном. В течение последующих 10 дней происходило восстановление эпигенетической репрессии репортерного гена, и изменение фенотипа клеток на GFP-отрицательный. Затем клетки вновь были отсортированы на GFP-негативный фенотип. Таким образом, в итоге была получена Трихостатин А Индуцируемая (ТИ) субпопуляция HeLa клеток, несущая молчащий ретровирусный репортерный ген.

Подобная процедура получения HeLa ТИ клеток была проделана с ретровирусными векторами несущими репортерный GFP ген под контролем CMV промотора (HeLa ТИ CMV), нативного вирусного LTR промотора (HeLa ТИ LTR), и клеточного промотора EF1 (HeLa ТИ EF1). Из полученной субпопуляции HeLa ТИ CMV клеток было выделено 11 индивидуальных клеточных клонов (HeLa CMV ТИ1 - ТИ11).

2. Применение методов РНК-интерференции для поиска клеточных генов участвующих в поддержании эпигенетического молчания

Ввиду того, что трихостатин А имеет широкий спектр ингибирования гистоновых деацетилаз 1-го (широкораспространенного) и 2-го (тканеспецифического) класса, были использовали методы, основанные на РНК-интерференции, для специфического нокдауна различных генов, представителей семейства гистоновых деацетилаз, с целью выявления конкретных представителей семейства, участвующих в поддержании ретровирусного эпигенетического молчания. Представители семейства гистоновых деацетилаз 1-го класса (HDAC1, HDAC2 и HDAC3) являются потенциальными кандидатами, участвующими в поддержании эпигенетического молчания, кроме того, для некоторых из них ранее было показано взаимодействие с ретровирусной ДНК после интеграции в геном клетки хозяина (Greger J.G. et al, 2005). Экспрессия гистоновой деацетилазы 4 (HDAC4), представителя 2-го класса, является тканеспецифичной, однако, ранее была показана экспрессия HDAC4 в HeLa клетках (Greger J.G. et al, 2005). В первоначальном эксперименте была осуществлена попытка повторить эффект ингибитора гистоновых деацетилаз Трихостатина А с помощью нокдауна генов-мишеней посредством трансфекции HeLa ТИ-CMV клеток специфичной миРНК. Клетки были трансфецированны специфическими пулами миРНК («SMARTpool», Dharmacon, США), состоящими из смеси четырех независимых миРНК. Как показано на рисунке 2, трансфекция субпопуляции ТИ-CMV клеток пулом миРНК против HDAC1 приводит к появлению значительного числа клеток экспрессирующих репортерный GFP ген, в то время как трансфекция миРНК против HDAC2, HDAC3 и HDAC4 не приводит к сколько либо значимой реактивации. Ранее была показана роль белка DAXX в связывании с ретровирусным преинтеграционным комплексом и инициации эпигенетического молчания после интеграции ретровирусной ДНК в геном клетки хозяина (Greger J.G. et al, 2005). Трансфекция субпопуляции ТИ-CMV клеток пулом миРНК специфичным к DAXX приводит к реактивации эпигенетически-молчащего ретровирусного репортерного гена (рисунок 2).

Для подтверждения специфичности нокдауна посредством миРНК был проанализирован уровень мРНК и белкового продукта генов-мишеней. Результаты ОТ ПЦР в реальном времени показали, что трансфекция клеток миРНК приводит к значительному (более 80%) снижению уровня мРНК гена-мишени (рисунок 3а). Определение количества белка методом Вестерн Блот подтвердило нокдаун гена-мишени на уровне белкового продукта (рисунок 3б). Полученные результаты подтвердили специфичность нокдауна гена-мишени на уровне мРНК и белкового продукта, а так же отсутствие неспецифического влияния на изменение уровней мРНК других генов (рисунок 3а).

В качестве одного из потенциальных кандидатов, участвующих в поддержании эпигенетического молчания, был проанализирован белок гетерохроматина 1 (HP1). В клетках млекопитающих данный белок представлен тремя изоформами: HP1-альфа (HP1), HP1-бета (HP1) и HP1-гамма (HP1). Для определения возможной роли различных изоформ данного белка в поддержании эпигенетического молчания клеточная линия HeLa ТИ клеток была трансфецирована пулами миРНК против изоформ белка HP1. Как показано на рисунке 4, нокдаун белка HP1 приводит к реактивации молчащего репортерного гена, в то время как нокдаун других изоформ HP1 и HP1, не вызывает увеличения GFP-положительных клеток более, чем трансфекционный реагент (DF1). Ввиду высокой гомологичности изоформ белка HP1, для подтверждения специфичности миРНК против конкретной изоформы белка HP1 был проведен анализ нокдауна белковых продуктов методом Вестерн Блот (рисунок 4). Полученные результаты подтвердили специфичность миРНК против гена мишени, а также отсутствие изменений количества других изоформ.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.