WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Экспрессия генов, контролирующих водно-солевой баланс в ткани почки гипертензивных крыс нисаг

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Абрамова Татьяна Олеговна

Экспрессия генов, контролирующих

водно-солевой баланс в ткани почки гипертензивных крыс НИСАГ

03.02.07 Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2013

Работа выполнена в лаборатории эволюционной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущее Учреждение:

Доктор биологических наук, профессор

Маркель Аркадий Львович

Меркулова Татьяна Ивановна

Доктор биологических наук, профессор

Зав. лабораторией регуляции экспрессии генов ФБГУН Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Дымшиц Григорий Моисеевич

Доктор биологических наук, профессор

Зав. кафедрой естественных наук Специализированного учебно-научного центра Новосибирского государственного университета, г. Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится __________________ 2013 года на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева 10, т\ф (383)363-49-06, Факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН

Автореферат разослан «____»______________2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

Доктор биологических наук Хлебодарова Т.М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Гипертоническая болезнь (ГБ) – широко распространенное, в подавляющем большинстве случаев полигенное заболевание человека, развитие которого связано с определенным вкладом большого числа генов, а также средовых факторов. Изучение природы гипертонии на всех уровнях, в том числе на молекулярно-генетическом, является актуальной научной задачей, имеющей большое практическое значение для клинической медицины. Одним из факторов развития ГБ является стресс (Gasperin et al. 2009). Однако, молекулярно-генетические механизмы, ответственные за развитие гипертонии при эмоциональном стрессе, изучены недостаточно.

Для исследования механизмов артериальной гипертонии широко используются модельные животные - инбредные линии крыс и мышей, которые воспроизводят разные формы и механизмы гипертензивных состояний. Для изучения стресса, как фактора, провоцирующего развитие гипертонии, в Институте цитологии и генетики СО РАН была создана путем селекции инбредная линия крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией (линия НИСАГ- ISIAH) (Markel et al. 1992, 1999). В отличие от других гипертензивных линий, крысы НИСАГ наиболее полно реализуют свою генетическую предрасположенность к гипертонии именно в условиях эмоционального стресса. Так как гипертония человека может иметь стресс-зависимую природу, то линия НИСАГ рассматривается в качестве адекватной биологической модели артериальной гипертонии человека.

Известно, что при ГБ почки вовлекаются в патологический процесс одними из первых. Структурные нарушения в них нередко являются важным морфологическим критерием при определении стадии, степени тяжести и прогноза заболевания. Имеющиеся данные о морфологии и гистологии почек у крыс линии НИСАГ указывают на их важную роль при развитии стресс-индуцируемой формы артериальной гипертензии (Шмерлинг и соавт. 2001, Антонов и соавт. 2010, Федосеева и соавт. 2011).

Мы предположили, что возникновение и поддержание гипертензивного статуса у стресс-чувствительных крыс НИСАГ, вероятно, происходит на фоне нарушения функции почек, обеспечивающих водно-солевой баланс организма.

Цель работы: Выявление генетических особенностей почечной регуляции водно-солевого баланса и артериального давления в покое и при эмоциональном стрессе у гипертензивных крыс НИСАГ.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определение генов с дифференциальной экспрессией в корковом и мозговом веществе почек гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG (контрольная линия) с помощью микроматриц. Проведение функциональной аннотации дифференциально экспрессирующихся генов и выявление изменений в метаболических путях в покое и после действия стресса.

2. Изучение межлинейных различий в экспрессии мРНК генов, регулирующих водно-солевой баланс, в почках крыс НИСАГ и WAG методом ПЦР в реальном времени.

3. Изучение влияния эмоционального стресса на экспрессию генов, обеспечивающих различия функционального состояния почек крыс НИСАГ и WAG, методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна работы. В данной работе впервые:



  • Проведено сравнение транскрипционной активности генов в мозговом и корковом веществе почек у крыс НИСАГ и WAG с помощью микроматриц. При межлинейных сравнениях в покое найдено 126 и 65 дифференциально экспрессирующихся генов в корковом и в мозговом веществе почек, соответственно. Среди них 61.1% генов в корковом веществе и 78.5% генов в мозговом веществе почек имеют более низкий уровень экспрессии мРНК у крыс НИСАГ по сравнению с WAG. В корковом веществе почек найдена группа из 38 генов, описываемая термином «ответ на стимул» (согласно базе данных «Gene ontology»), включающая в себя гены, относящиеся к ответу на внешний стимул, ответу на гормональный стимул, регуляции ответа на стресс.
  • Методом ПЦР в реальном времени исследована транскрипционная активность генов Mlr (минералокортикоидный рецептор), -ENaC и -ENaC (эпителиальный натриевый канал, - и -субъединицы), Egf (эпидермальный фактор роста), Egfr (рецептор эпидермального фактора роста), Ephx2 (эпоксидгидролаза 2), Comt (катехол-О-метилтрансфераза) в корковом и мозговом веществе почек крыс линий НИСАГ и WAG в покое и после действия эмоционального стресса.
  • При межлинейных сравнениях в покое для крыс линии НИСАГ со стресс-чувствительной гипертонией в корковом веществе почек показано, что характерной особенностью является более высокий уровень экспрессии мРНК генов Egfr, Ephx2, и более низкий уровень экспрессии мРНК генов -ENaC, Mlr, Соmt по сравнению с контрольными нормотензивными крысами. В мозговом веществе почек крыс линии НИСАГ показан более высокий уровень экспрессии мРНК генов Egfr, Mlr, Ephx2 и более низкий уровень экспрессии -ENaC, Соmt.
  • В условиях эмоционального стресса в корковом веществе почек у крыс линии НИСАГ отмечено повышение уровня транскрипции мРНК гена -ENaC. В мозговом веществе почек действие эмоционального стресса вызывало повышение транскрипции мРНК генов -ENaC, -ENaC и Ephx2 у крыс НИСАГ.
  • Показано, что возникновение и поддержание гипертензивного статуса у стресс-чувствительных крыс НИСАГ сопровождается изменением транскрипционной активности генов почки, что может приводить к таким последствиям как усиление симпатической стимуляции органа, увеличение местного сосудистого сопротивления, и к нарушению водно-солевого баланса.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы.

Работа расширяет имеющиеся представления о механизмах участия почки в становлении стресс-чувствительного гипертензивного статуса. Данные по микроматрицам могут быть использованы для создания подробной картины нарушений функционирования почки при стресс-зависимой форме артериальной гипертонии. Данные о дифференциальной экспрессии генов у гипертензивных и нормотензивных крыс могут быть полезны для дальнейших исследований с целью разработки новых фармакологических препаратов с гипотензивным действием.

Положения, выносимые на защиту:

  • Большая часть дифференциально экспрессирующихся генов в почках крыс НИСАГ и WAG связана с ответом на стресс. Корковое и мозговое вещество почек различно реагирует на воздействие мягкого эмоционального стресса.
  • Развитие гипертензивного статуса у крыс НИСАГ связано с изменением активности генов в ткани почки, участвующих в регуляции функции симпатической нервной системы, водно-солевого баланса, а также сосудистого сопротивления.

Апробация результатов.

Материалы диссертации обсуждены на конференциях «Genomics Research. Asia» (г. Тэджен, 2012), «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика», (г. Новосибирск, 2011), «Fundamental Medicine: From Scalpel toward Genome, Proteome and Lipidome» (г. Казань, 2011), «Медико–биологические аспекты мультифакторных патологий» (г. Курск, 2011), «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (г. Новосибирск, 2011), «Студент и научно технический прогресс» (г. Новосибирск, 2011), «Студент и научно технический прогресс» (г. Новосибирск, 2010), «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure» (BGRS'2010) (г. Новосибирск, 2010), отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск, 2010).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 научных статьи в рецензируемых отечественных изданиях и 19 тезисов в сборниках трудов конференций.

Структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 150 страницах печатного текста, содержит 27 рисунков, 13 таблиц и 6 приложений. Библиографический указатель литературы включает 228 источников, из них 25 отечественных и 203 зарубежных.

Материалы и методы

Экспериментальные животные: В эксперименте использовали крыс - самцов двух инбредных линий: гипертензивных крыс линии НИСАГ и нормотензивных крыс линии WAG (Wistar Albino Glaxo) в возрасте 6 -7 месяцев.

Для измерения артериального давления применяли как прямой, так и непрямой метод (Bunag et al. 1973). Животных содержали в стандартных условиях вивария ИЦиГ СО РАН, воду и пищу давали без ограничения. Стресс вызывали помещением крысы в тесный проволочный домик на 2.5 часа. Для получения образцов тканей почки крыс декапитировали, почку быстро выделяли, делали поперечный срез. На срезе разделяли корковое и мозговое вещество. Для анализа транскрипционной активности генов на микроматрицах полученные образцы тканей (50 мг) сразу после выделения гомогенизировали в 1мл тризола (TRIzol reagent, Invitrogen, USA). Для анализа транскрипционной активности генов методом ПЦР в реальном времени остальную часть почки замораживали в жидком азоте и хранили при -70оС до выделения РНК. Изучение экспрессии методом ПЦР в реальном времени проводили у крыс в состоянии покоя и после эмоционального стресса отдельно в корковом и мозговом веществе почек (n=5 в каждой группе). Все эксперименты выполнены в соответствии с Международными правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных.





Олигонуклеотиды синтезированы ООО «Биоссет» и ООО «Биосан» (Новосибирск) с очисткой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Выделение суммарной РНК из тканей крыс и удаление хромосомной ДНК из препаратов РНК проводилось с помощью набора SV total RNA isolation system (Promega, USA) согласно инструкции производителя.

Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот и амплифицированных ПЦР фрагментов проводили в агарозном либо полиакриламидном гелях с использованием стандартных методов (Маниатис и соавт. 1984). Спектрофотометрический анализ количества РНК проводили на спектрофотометре «Eppendorf BioPhotometer Plus (Eppendorf, Germany). Качество препаратов РНК оценивали, сравнивая поглощение при длинах волн 230, 260 и 280 нм.

Реакция обратной транскрипции РНК проводилась со специфическими праймерами в объёме 20 мкл. 2 мкг РНК, обработанной ДНКазой, денатурировали 5 мин при 70°С, далее проводили отжиг со смесью специфических праймеров (по 75 нг каждого) в течение 4 мин при 37°С. Реакцию проводили в буфере для ревертазы, содержащем 500 мкМ каждого из 4-х dNTP и 400 ед. акт. РНК-зависимой ДНК-полимеразы MoMLV в течение 10 мин при 37°С, 40 мин при 42°С. Реакцию останавливали инактивацией фермента в течение 5 мин при 70°С. Полученную кДНК хранили при -70°С.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) проводилась на амплификаторе ABI PRISM 7000 Sequence Detector System (Applied Biosystems, USA) с использованием набора реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq ДНК-полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами в присутствии красителя SYBR GreenI и референсного красителя ROX (Синтол, Москва) согласно рекомендациям производителя. Анализ проводили на 96-луночных планшетах (Axygen 96M2-HS-C, США) в объеме 25 мкл с использованием 10х ПЦР буфера, 250 мкМ каждого из четырех dNTP, 200 нМ каждого праймера, с добавлением 0.1 мкл продукта обратной транскрипции и 1.2 ед. активности фермента Taq ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили по стандартной схеме, при температуре отжига 62оС. Температуру детекции сигнала подбирали для каждого гена согласно кривой диссоциации. Для контроля специфичности реакции снимали кривые плавления. В качестве гена сравнения использовали ген циклофилина (Ppia) экспрессия которого, согласно данным микрочипов не различалась между линиями в покое и при стрессе, как в корковом, так и в мозговом веществе почек. В каждом эксперименте на один планшет помещали образцы кДНК с праймерами на целевой ген (по 4 повтора для каждого образца кДНК) и аналогичные образцы с праймерами на ген сравнения (также по 4 повтора). Каждый образец кДНК анализировали на двух планшетах. Относительный уровень экспрессии генов определяли методом Сt. В качестве образца-калибратора использовали результаты измерения, полученные для крыс нормотензивной линии WAG в покое.

Сравнительный анализ экспрессии 22228 генов на микроматрицах (RatRef-12 Expression BeadChip, Illumina, Inc., California, USA) между линиями крыс НИСАГ и WAG был проведен в корковом и в мозговом веществе почки. Исследовали крыс самцов обеих линий в покое и после воздействия эмоционального стресса. Исследовали по 3 крысы в каждой группе индивидуально. Межлинейные различия определяли по соотношению НИСАГ в покое/WAG в покое и НИСАГ при стрессе/WAG при стрессе. Выделение РНК, гибридизация и компьютерная обработка полученных результатов в программе BeadStudio выполнялись в фирме ЗАО «Геноаналитика» (г. Москва, Россия).

Базы данных: Rat Genome Database (RGD) ( http://www.rgd.mcw.edu/ ) использовался для поиска генов, относящихся к развитию гипертензии. Инструмент DAVID 2008 (http://david.abcc.ncifcrf.gov) - для функциональной аннотации дифференциально экспрессирующихся генов в терминах Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Статистический анализ результатов гибридизации и определение генов, дифференциально экспрессирующихся в почках крыс НИСАГ и WAG, проводили в программе BeadStudio с использованием gene expression module, rank invariant нормализацией и p < 0.01. Результаты ПЦР-РВ обрабатывали программой 7000 System SDS Software RQ Study Application (Applied BioSystems, USA) в автоматическом режиме. Достоверность различий в экспрессии мРНК генов оценивали с помощью непараметрического парного критерия Вилкоксона.

Результаты и обсуждение

Значения уровней артериального давления у крыс НИСАГ и WAG представлены в Табл. 1.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.