WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Филогенетические взаимоотношения в роде pisum l., реконструированные на основе генов гистона h1 генетика-

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи


ЗАЙЦЕВА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В РОДЕ PISUM L., РЕКОНСТРУИРОВАННЫЕ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ГИСТОНА H1




Генетика- 03.02.07








АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук





Новосибирск 2013

Работа выполнена в лаборатории генетики и эволюции бобовых растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Костерин Олег Энгельсович


Официальные оппоненты: Гончаров Николай Петрович,

доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН, заведующий сектором генетики пшениц

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Агафонов Александр Викторович,

доктор биологических наук, старший

научный сотрудник, ведущий научный

сотрудник лаборатории интродукции редких

и исчезающих видов растений

Центральный сибирский ботанический сад

СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва



Защита диссертации состоится «___» ____________ 20___ г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева, 10, т./ф. (383)363-49-06,
факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан «___» _____________ 20___ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гистон Н1 является одним из основных компонентов хроматина эукариотической клетки. Он обеспечивает наднуклеосомную упаковку ДНК (Allan et al., 1980, 1986) и, в отличие от коровых гистонов, проявляет значительную вариабельность, вплоть до внутривидового полиморфизма у некоторых организмов (Kosterin et al., 1994). В клетке гистон Н1, как правило, представлен несколькими субтипами. Спектр гистона Н1 претерпевает существенные изменения в онтогенезе клетки (Cole, 1987), особенно в процессе ее дифференцировки. Так как гистон Н1 вовлечен в процессы компактизации хроматина и его вторичная структура близка структуре факторов транскрипции, этот белок часто рассматривается в контексте его влияния на регуляцию дифференциальной экспрессии генов (Ramakrishnan et al., 1993).

Ввиду своей высокой вариабельности, гистон Н1 может использоваться как удобный объект для молекулярной филогении на микроэволюционном уровне. Поскольку в молекуле гистона Н1 гидрофильные домены эволюционируют с большей скоростью, чем гидрофобный (Ponte et al., 1998), первичная структура генов Н1 может применяться для оценки эволюционного расстояния в разных временных масштабах. Есть свидетельства важной роли изменчивости гистона Н1 в процессах адаптивной эволюции. Установлено, что у насекомых существует корреляция между вариабельностью аминокислотной последовательности С-концевого домена гистона Н1 в пределах отряда и числом современных видов в отряде, но не с эволюционным возрастом отряда, что свидетельствует об определенной адаптивной составляющей изменчивости гистона Н1 (Berdnikov et al., 1993a). В частности, установлено, что частота одного из аллелей субтипа 5 гистона Н1 гороха в региональных выборках коррелирует с суммарной температурой за вегетационный период (Berdnikov et al., 1993b).

Удобной моделью для изучения влияния структуры гистона Н1 на фенотип и его роли в эволюционном процессе является горох (Pisum L.), так как он имеет внутривидовой аллельный полиморфизм по всем субтипам гистона Н1, у него хорошо разработана частная генетика и он имеет короткое время генерации. На настоящий момент у гороха известно 7 неаллельных субтипов гистона Н1, каждый из которых кодируется отдельным геном: ген His1, кодирующий гистон Н1-1, находится на З-й хромосоме, ген His7 и тесно сцепленный кластер генов His(2-6) - на 6-й (Kosterin et al., 1994).



Горох является ценной сельскохозяйственной культурой, история возделывания которой насчитывает около 12 тысяч лет (Ben-Ze’ev, Zohary, 1973). Кроме того, это один из классических объектов генетики. Вместе с тем, существует большое разнообразие диких форм гороха, произрастающих в Средиземноморье. Дикие популяции представляют особый интерес как материал для реконструкции происхождения культурных форм гороха, а также в качестве потенциальных доноров хозяйственно-ценных признаков для селекции.

В настоящее время таксономия рода Pisum достаточно запутана и несовершенна в связи с тем обстоятельством, что горох является преимущественно самоопылителем и его локальные популяции весьма отличны друг от друга. Кроме того, этот род содержит как дикие, так и культурные формы, причем некоторые формы были введены в культуру независимо (Vershinin et al., 2003). Культурные формы гороха отличаются большой вариабельностью морфологических признаков, что также усложняет систематику этого рода.

Всеми современными исследователями признается выделение внутри рода Pisum L вида Pisum fulvum Sibth. et Smith. Многие исследователи приписывают статус вида также локально культивируемому в Эфиопии и Йемене P. abyssinicum A. Br., чего придерживаемся и мы. Что касается наиболее гетерогенного вида Pisum sativum L., то большинство авторов сходятся на том, что он объединяет все остальные формы гороха, дикие и культурные. Однако, в дальнейшем подразделении P. sativum на подвиды нет полного согласия.

Для изучения эволюционных отношений внутри рода Pisum L. мы построили филогенетические реконструкции по генам гистона H1 His5 и His7, кодирующих соответственно субтипы Н1-5 и H1-7. Нами также предпринята попытка филогеографического анализа диких популяций гороха на основании распределения комбинаций аллелей трех функционально не связанных молекулярных маркеров из трех клеточных геномов. Полученные данные позволили нам прояснить эволюционные взаимоотношения внутри рода Pisum L

Цели и задачи исследования. Целью работы являлась реконструкция филогенетических взаимоотношений и филогеографии в роде Pisum с использованием последовательности генов гистона Н1.

Были поставлены следующие задачи:

1. Установление нуклеотидных последовательностей и изучение изменчивости генов His5 и His7 у ряда представителей рода Pisum и реконструкция на этом основании филогении последних;

2. Сравнение между собой филогенетических реконструкций, выполненных на основе генов His5 и His7;

3. Изучение географического распределения и распространения в таксономических группах гороха комбинаций вариантов пластидного и митохондриального CAPS-маркеров и электроморф белка SCA, сопоставление этих данных с филогенетическими реконструкциями;

4. Филогеографическая реконструкция истории возникновения и распространения диких и эндемичных культивируемых форм гороха;

5. Оценка информативности пластидного межгенного спейсера psbA-trnH как маркера для изучения эволюции рода Pisum L. и сравнение его с генами гистона Н1 в отношении информативности.

Научная новизна. Впервые гены линкерного гистона Н1 введены в филогенетический анализ на межвидовом и межпопуляционном уровнях и применены к сложному роду, включающему диких и культурных представителей. Этот филогенетический анализ дополнен детальным рассмотрением географического происхождения исследуемых дикорастущих форм, т.е. впервые для дикорастущего гороха был применен последовательный филогеографический подход.

Научно-практическая ценность. Результаты данной работы углубляют представления о филогенетических отношениях диких сородичей важной сельскохозяйственной культуры, что может способствовать их более эффективному использованию в селекции.

Показана перспективность генов гистона Н1 для филогенетического анализа на внутривидовом уровне.

Личный вклад автора. Автор самостоятельно провел электрофоретический анализ гистона Н1 и SCA, CAPS-маркеров у 12 образцов гороха, определение нуклеотидной последовательности гена His5 у 59 образцов гороха, гена His7 у 22 образцов гороха, пластидного межгенного спейсера psbA-trnH у 56 образцов гороха, а также обработку экспериментальных данных. Определение нуклеотидной последовательности гена His5 у 9 образцов гороха, анализ CAPS-маркеров и белка SCA у остальных 97 образцов выполнен В. С. Богдановой и О. Э. Костериным.

Основные положения, выносимые на защиту.

В Западном Средиземноморье внутри P. sativum subsp. elatius возникла особая эволюционная ветвь, эволюционные потомки которой затем мигрировали в Тавро-Кавказский регион и Малую Азию, где дали начало культурной ветви P. sativum subsp. sativum.

Ген His5 субтипа H1-5, в отличие от гена His7, может быть использован в качестве филогенетического маркера для реконструкции эволюционных взаимоотношений в роде Pisum L.

Последовательности пластидного межгенного спейсера psbA-trnH специфичны для двух независимо введенных в культуру форм гороха - P. sativum subsp. sativum и P. abyssinicum.

Апробация. Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН в 2011 г., 2й Московской Международной конференции "Молекулярная филогенетика" (2010), Международной конференции по генетике растений «Геномика и биотехнологии» (Новосибирск, 2010), 14й Конференции по молекулярной эволюции в Марселе (2010), IV Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 2010), 16й Конференции по молекулярной эволюции в Марселе (2012).





Публикации. Материал диссертации представлен в 3 публикациях в зарубежных журналах, реферируемых в ISI Web of Science, и в 6 тезисах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 95 источников (в том числе на иностранном языке 91). Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 26 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В работе использовались образцы гороха, полученные из коллекций Всероссийского института растениеводства (Санкт-Петербург), коллекции Вейсбуллхольм (Ландскрона), центра Джона Иннеса (Норвич), а также собранные в природе О.Э. Костериным, Michelle Papazyan и Josep Vigo.

Выделение гистона Н1. Гистон Н1 выделяли из гомогенизированных тканей растения модифицированным методом Джонса (Johns, 1964). SCA выделяли экспресс-методом из семян (Smirnova et al., 1992). Электрофорез проводили по методу Панима и Чокли (Panyim, Chalkley, 1969) с изменениями (Бердников, Горель, 1975) в 15% ПААГ.

Выделение ДНК. ДНК выделяли из тканей растений литий-хлоридным методом (Bogdanova et al., 2010). Электрофорез проводили в 0,7-0,8% геле.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей образцов проводили в Межинститутском Центре Секвенирования. Компьютерный анализ полученных секвенограмм выполняли с помощью пакета программ Staden (Staden et al., 1998).

Компьютерный анализ данных. Выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществлялось с помощью пакета программ MEGA 5.1 (Tamura et al., 2011) и online-сервиса MultAlin (Corpet, 1988). Расчет эволюционных дистанций и построение филогенетических деревьев производились при помощи пакета программ MEGA 5.1 и MrBayes (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Филогенетические деревья были построены по кодирующим последовательностям (без интрона) генов His5 и His7 методами ближайших соседей, максимальной парсимонии, максимального правдоподобия и байесовским. При построении филогенетических деревьев в качестве внешней группы были использованы белок-кодирующие нуклеотидные последовательности генов Vavilovia formosa (единственный представитель монотипического рода, сестринского роду Pisum), ортологичных соответственно генам His5 и His7 гороха. Нуклеотидное разнообразие оценивали при помощи пакета программ DnaSPv5 (Librado, Rozas, 2009). Генеалогия аллелей гена His5 построена при помощи программы TCS (Clement et al., 2000). Детекцию рекомбинации в объединенных последовательностях His5 и His7 проводили при помощи пакета программ RDP5 (Martin et al., 2010) методами RDP, GENCONV, Chimaera, MaxChi, BootScan, SiScan и 3Seq.

РЕЗУЛЬТАТЫ и обсуждение

Анализ распределения комбинаций трех диморфных маркеров у диких и культурных форм гороха. Амплифицированная часть хлоропластного гена rbcL составляет 1129 п.н. в длину. В ней либо содержится, либо отсутствует сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции AspLEI, которая разрезает ампликон на два фрагмента, приблизительно 800 п.н. и 300 п.н. длиной. Потеря сайта рестрикции связана с синонимичной нуклеотидной заменой C->T в позиции 325 от начала праймера, использованного для амплификации (Kosterin, Bogdanova, 2008). Далее в тексте, вариант с наличием сайта рестрикции обозначен rbcL+, без – rbcL-.

ПЦР-продукт, амплифицированный с митохондриального гена coxI составляет примерно 1200 п.н. и либо содержит, либо лишен сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции PsiI, которая расщепляет ампликон на два фрагмента, размером приблизительно 260 и 940 п.н. Потеря сайта рестрикции связана с несинонимичной заменой C->A, которая приводит к замене остатка лизина на остаток глутамина (Kosterin et al., 2010).

Альбумин семядолей SCA представлен у гороха двумя электрофоретическими вариантами: SCAf и SCAs, содержащими 10 и 9 остатков лизина соответственно. Поскольку в примененных условиях электрофоретического разделения заряд белка определяется числом аминокислотных остатков аргинина, лизина и гистидина, разница в числе остатков лизина сказывается на электрофоретической подвижности варианта.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.