WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

      влияние переохлаждения на функциональную активность лейкоцитов  

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи 

 

 

Степанова Евгения Сергеевна

 

 

 

ВЛИЯНИЕ ПЕРЕОХЛАЖДЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ

 

03.03.01 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

 

Москва

2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

 

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Сведенцов Евгений Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Василевская Людмила Сергеевна

доктор биологических наук, доцент

Сизова Елена Николаевна

Ведущая организация:  ГОУ ВПО «Челябинская государственная

медицинская академия» Федерального

агентства по здравоохранению и социальному

развитию

 

Защита состоится 21 марта 2010 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129164 Москва, ул. Кибальчича, д.6, корп. 4, ауд. 205

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119991 Москва, ул. Малая Пироговская, д.1

 

Автореферат разослан «___» ______________2010 г.

 

Ученый секретарь

диссертационного совета Холмогорова Н. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из наиболее чувствительных популяций лейкоцитов к воздействиям различных стресс-факторов являются гранулоциты, что связано с их более сложной структурной организацией (Гребенюк А.Н. с соавт., 1998; Давтян Т.К., Аванесян Л.А., 2001). Благодаря своему уникальному положению в системе неспецифической резистентности и иммунитета, а также наличию рецепторов к огромному числу биологически активных веществ, они быстро реагируют на состояние окружающей их среды, изменяя деятельность различных систем клетки (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов С.В., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001).

Данный компонент крови является крайне необходимым для клинических целей при лейкопении, угнетении функциональной активности фагоцитов, признаках вторичного иммунодефицита в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета, заболеваниях инфекционного характера: менингите, перитоните, сепсисе и других (Шалаев С.А. и соавт., 1990; Рыжков С.В. и соавт., 1992, 1995; Cairo M.S. et. al., 1992; Абдулкадыров К.М., 1994; Мельникова В.Н. и соавт., 1995; Ханевич М.Д., Маринин А.В., 1995; Neppert J., 1996; Vamvakas E.C. et al, 1996; Нerzog R., 1999; Muncunill J., 1999; Schiffer C., 1999; Балашов Д.Н., 2001; Гордеев В.И., 2003; Sputtek A., 2004). Широкому распространению использования гранулоцитов мешает ряд нерешенных проблем, в том числе связанных с их низкой устойчивостью, необходимостью наличия больших доз для получения терапевтического эффекта.

Ранее лейкоцитный концентрат (ЛК) сохраняли только криоконсервацией, то есть замораживанием биообъекта (–20°С–196°С), при этом лейкоциты находились в состоянии анабиоза (Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С. и соавт., 1978; Ермолович С.В., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1983; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004; Деветьярова О.Н., 2005; Утемов С.В. и соавт., 2005; Щеглова О.О., 2005). Однако после размораживания ЛК функциональная активность гранулоцитов часто оказывалась на низком уровне, что негативно сказывалось на качестве ЛК и его терапевтическом эффекте. Поэтому проблема оптимизации условий сохранения функций гранулоцитов крови человека вне организма является весьма актуальной на сегодняшний день. По существующей классификации отрицательных температур (Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., 2007) температура –10°С относится к температурам переохлаждения, при которой не замерзают все виды внутриклеточной и внеклеточной воды. Биообъект, охлажденный до данной температуры, не замерзает, а входит в состояние гипобиоза, характеризующееся незначительным замедлением метаболизма в клетке. В отечественной и зарубежной литературе нами не было обнаружено метода сохранения функций гранулоцитов в данном состоянии. Использование температуры переохлаждения позволит избежать последствий холодового стресса, в частности разрушения мембран кристаллами льда, вымораживания воды, гиперконцентрации солей, и применять ЛК в физиологически полноценном состоянии для клинических целей.

Цель исследования изучить функциональную активность лейкоцитов крови человека при использовании переохлаждения (–10°С) под защитой специально созданных хладоограждающих растворов.

Задачи исследования:

  1. Разработать способ введения лейкоцитов без потери их функциональной активности в холодовой гипобиоз путем нелинейного охлаждения до –10°С.
  2. Создать незамерзающие при температуре переохлаждения и не требующие отмывания от биообъекта хладоограждающие растворы, позволяющие сохранять функциональную полноценность лейкоцитов человека при их переохлаждении до –10°С.
  3. Изучить физиологическое состояние гранулоцитов, подвергнутых холодовому стресс-воздействию под защитой созданных хладоограждающих растворов.
  4. Определить токсичность, апирогенность предложенных хладоограждающих растворов и переносимость трансфузий ЛК, подвергнутого переохлаждению.

Научная новизна. Впервые сохранена физиологическая активность лейкоцитов крови человека в течение 12 суток путем их переохлаждения до –10°С.



Впервые показано, что влияние холодового стресс-фактора температуры переохлаждения устраняется при помощи созданного метода введения клеток в гипобиоз, включающего нелинейную программу охлаждения и оригинальные незамерзающие при -10°С хладоограждающие растворы.

На основании исследования функциональной активности гранулоцитов крови человека, перенесших холодовое стресс-воздействие, выявлен оптимальный состав и дано научное обоснование криозащитных свойств предложенных хладоограждающих растворов (получен патент РФ № 2261 595 от 10.10.2005).

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили создать метод сохранения лейкоцитов периферической крови в функционально активном состоянии, что создало основу для разработки надежных и безопасных методов хранения высокоспециализированных клеток. Работа развивает представления о механизмах холодового повреждения и защиты ядерных клеток крови человека в условиях температуры переохлаждения.

Предложенный эффективный и доступный метод отличается простотой в техническом исполнении и требует применения только электрического холодильника с морозильной камерой на -100С и разработанных хладоограждающих растворов.

Установлено, что разработанный способ сохранения лейкоцитов и их функциональной активности в течение 12 суток путем введения в холодовой гипобиоз (-10°С) под защитой созданных хладоограждающих растворов может быть рекомендован для внедрения в практику научных биологических и медицинских учреждений.

Положения, выносимые на защиту:

  1. При использовании температуры переохлаждения (-10°С) гранулоциты под защитой растворов, содержащих желатиноль или модежель, сохраняют функциональную активность после холодового воздействия в течение 12 суток (максимальный срок хранения).
  2. Для введения в состояние холодового гипобиоза (-10°С) лейкоцитов крови человека предлагается применять разработанные хладоограждающие растворы, включающие глицерин, сукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина (ОМЭПС) и препараты желатина (модежель или желатиноль) с использованием нелинейной трехэтапной программы охлаждения клеток.
  3. Разработанный хладоограждающий раствор, содержащий желатиноль, является нетоксичным, апирогенным, хорошо переносится экспериментальными животными и не требует отмывания от биообъекта после его отогрева.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003); на XV Коми Республиканской молодежной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004); на XIX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004), на объединенном заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов и Кировского отделения общества физиологов им. И.П. Павлова (Киров, 2008), на Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар, 2008).

Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал участие в создании метода введения лейкоцитов в гипобиоз при –100С, в определении оптимального состава незамерзающих хладоограждающих растворов, проводил все экспериментальные работы по изучению функциональных и морфологических свойств нативных и вышедших из холодового гипобиоза гранулоцитов, статистическую обработку полученных результатов, участвовал в написании статей и докладов по теме диссертации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано пятнадцать печатных работ, из них две статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, одна в республиканском журнале и одна в международном. Получен патент на изобретение «Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре –100С» № 2261595 от 10.10.2005.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, списка литературы и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Диссертация иллюстрирована 29 таблицами и 17 рисунками. Список литературы содержит 186 и 70 источников отечественных и зарубежных авторов соответственно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовали гранулоциты крови человека в составе ЛК – трансфузионной среды с содержанием лейкоцитов в 4–8 раз больше, чем в периферической крови, с примесью эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы. В целом, проведено 136 экспериментов, более 2000 исследований по изучению холодового влияния на функциональные свойства гранулоцитов.

ЛК получали с информированного согласия от 42 доноров-добровольцев в отделении гравитационной хирургии крови клиники Федерального государственного учреждения Кировского научно-исследовательского института гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства Минздравсоцразвития (ФГУ КНИИГиПК ФМБА) методом цитафереза периферической крови. Использовали центрифугу фирмы «Sorvеll» (США) при ускорении 1170•g (2500 об/мин, охлаждение 5 мин) и консервант цитратфосфатдекстрозу (CDF). Полученное количество ЛК в среднем составляло 27,2±12,2 мл. Все доноры были от 25 до 44 лет, в среднем 35,6±4,9.





Перед охлаждением ЛК смешивали в соотношении 1:1 с хладоограждающим раствором в пластикатном контейнере "Компопласт 300". Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого контейнер с биоматериалом погружали в заполненную хладоносителем (96%-ный этиловый спирт) и охлажденную до -10оС 4-х-литровую ванну камеры электрического морозильника «Криостат». Регистрацию температуры осуществляли с помощью прибора ГСП-04 в составе программного замораживателя УОП 700.00.00 (Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины). Его датчик ТСМ-3-02 был установлен в одном из контейнеров с имитатором (хладоограждающим раствором с конечной концентрацией его ингредиентов). Скорость движения ленты самописца составляла 240 мм/ч. Далее биообъект переносили для хранения в герметично закрытую емкость, заполненную 45%-ым этиловым спиртом, охлажденным до -100С, и помещали в морозильную камеру (-10оС) электрического холодильника. Отогрев проводили через: 1, 5, 7, 9, 11, 12 и 14 суток в 10-литровой водяной ванне при температуре +380С в течение 2-4 сек при интенсивном покачивании контейнера.

Измерение рН ЛК проводили на ионометре Эксперт-001 фирмы «Эконикс-эксперт» (Россия) стеклянными электродами при комнатной температуре после смешивания клеток с хладоограждающим раствором до охлаждения и после их отогрева.

Изучение функциональных свойств гранулоцитов осуществляли по указанным далее методикам до введения их в холодовой гипобиоз и после выхода из него.

Количество гранулоцитов определяли по формуле: КГ = КЛ •доля Г, где КГ - общее количество гранулоцитов в мкл, КЛ - общее количество лейкоцитов в мкл, доля Г - доля гранулоцитов (по данным лейкоформулы). Подсчет КЛ проводили в камере Горяева (286 проб) общепринятым методом (Никанкина Л.В. и соавт., 2001). Для разрушения эритроцитов использовали 0,4 мл 3-5 % уксусной кислоты, которую смешивали с 0,02 мл ЛК и оставляли на 10 мин. Определение лейкоформулы осуществляли путем подсчета процента различных видов лейкоцитов в составе ЛК (в 286 пробах) по методу Г.И. Козинца (1998).

Жизнеспособность ядерных клеток крови (286 проб) определяли в пробах исключения эозина по методу Шрека (Shreck R., 1936). При нарушении целостности мембраны клетки диффузно окрашивались в розовый цвет.

Фагоцитарную активность нейтрофилов (286 проб) оценивали по методу С.Г. Потаповой и соавторов (1977), где в качестве объекта фагоцитоза применяли взвесь частиц инертного полистирольного латекса (Sigma, США; диаметр частиц 1,03 микрона), разведенного 1:200 в среде Хенкса, который в количестве 0,05 мл смешивали с 0,1 мл ЛК. Вычисляли фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) – процент фагоцитирующих нейтрофилов и фагоцитарный индекс (ФИ) – количество захваченных частиц латекса клеткой. Кроме того, вычисляли абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов (абс.ФАН) и абсолютный фагоцитарный показатель (АФП) – суммарный показатель активности нейтрофилов (СП 3.3.2.561–96), которые рассчитывали по формулам:

Абс.ФАН = ФАН • абсолютное количество нейтрофилов

АФП = абс.ФАН • ФИ

Активность азурофильных и специфических гранул нейтрофилов (130 проб) определяли по методу А.А. Славинского и соавт. (1999) в ЛКБ – тесте.

Оценку окислительно-восстановительного метаболизма в нейтрофилах (286 проб) осуществляли визуально-цитохимически с помощью НСТ-теста по методу Парка (Park B., 1969). Подсчет производили на 100 нейтрофилов путем определения процента клеток с диформазаном (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992).

Изучение «острой», «хронической» токсичности и пирогенности разработанных равноценных хладоограждающих растворов проводили на растворе, содержащем желатиноль, на белых мышах (n=30) и кроликах неальбиносах (n=13) [согласно методикам XI-ой Государственной Фармакопеи (ГФ, 1990)]. Также изучали переносимость трансфузий аутологичных ЛК, подвергавшихся холодовому гипобиозу с исследуемым хладоограждающим раствором на экспериментальных животных (собаках, n=3). Исследовательскую работу проводили в экспериментально-биологической клинике ФГУ КНИИГиПК ФМБА, а также в виварии ГОУ ВПО Вятской государственной сельскохозяйственной академии.

Изучение стабильности применяемого хладоограждающего раствора для лейкоцитов проводили на трех его сериях методом ускоренного старения (Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода “Ускоренного старения” при повышенной температуре, 1983), при котором образцы выдерживали в течение 45 суток при +600С, что соответствовало двум годам хранения при +40С. Изучили девять флаконов с исходным составом применяемого в опытах криозащитного раствора и такое же количество раствора без содержания желатиноля в эксперименте по введению гранулоцитов в холодовой гипобиоз.

Полученные данные были подвергнуты статистической обработке при помощи компьютерной программы для медико-биологической статистики BIOSTAT.EXE: вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение (M±у). Достоверность различия между показателями оценивали по критерию Уилкоксона (Гланц С., 1998). Результаты считали достоверными при p<0,05.

Фотосъемку биологического объекта проводили с помощью видео-окуляра USB марки DSM 130 и программного обеспечения ImageBase 1.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.