WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Влияние наноразмерных частиц оксида железа на морфо-функциональное состояние внутренних органов крыс

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Мильто Иван Васильевич

ВЛИЯНИЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ ОКСИДА ЖЕЛЕЗА НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ КРЫС

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Томск – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Суходоло Ирина Владимировна

кандидат биологических наук, доцент Климентьева Татьяна Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Петрова Ирина Викторовна

доктор биологических наук, профессор Гришанова Алевтина Юрьевна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный университет»

Защита диссертации состоится «­___» ________ 2010 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.096.03 при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (634050, г. Томск, пр. Ленина, 107)

Автореферат разослан «­___» ___________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Герасимов А.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Развитие технологий, основанных на применении наноразмерных материалов в биологии и медицине, открывает широкие возможности для создания новых методов диагностики и лечения заболеваний человека и животных различной этиологии [Martina M.S. et al., 2005; Fortin-Ripoche J.P. et al., 2006; Neilsen O.S. et al., 2001; Lubbe A.S. et al., 1999; Pankhurst Q. A. et al., 2003; Berry C. et al., 2003; Rosi N.L. et al., 2005].

Широкое распространение получили наноматериалы неорганического происхождения, в том числе наноразмерные частицы оксида железа [Tan M.H. et al., 1996; Ito A. et al., 2003; Weissleder R. et al., 1995; Warheit D.B. et al., 2003; Zhang Y. et al., 2002]. Наноразмерные частицы оксида железа изучаются, как основа для создания высокоэффективных систем очистки биологических жидкостей, магнитоуправляемых систем целевой доставки терапевтических агентов, как самостоятельные терапевтические агенты для локальной гипертермии, а также как контрастные вещества при магнитно-резонансных исследованиях [Gu H. et al., 2006; Bonnemain B. et al., 1998; Perez J.M. et al., 2002; Jendelova P. et al., 2004].

Преобладающее количество работ посвящено изучению свойств наноматериалов in vitro [Беликов В.Г., 2004; Pankhurst Q. A. et al., 2003; Gu H. et al., 2006; Dobson G., 2006; Koneracka M. et al., 1999; Kouassi G.K. et al., 2005; Krofitz F. et al., 2003]. Имеется сравнительно мало работ по влиянию различных видов наноматериалов на организменном уровне [Bonnemain B. et al., 1998; Park J.W., 2002; Nishimori H. et al., 2009; Moore A. et al., 2000]. Не изучена фармакокинетика и фармакодинамика наноматериалов, неоднозначно определены органы-мишени, характер вызываемых в них изменений, механизмы защитных и компенсаторно-приспособительных реакций, вызываемых в организме после их использования. Изучение взаимодействия наноматериалов с организмом является необходимым этапом исследований при разработке их биомедицинского приложения и обязательным условием для создания терапевтических средств нового поколения.

Цель исследования: изучить влияние внутривенного введения наноразмерных частиц магнетита на морфо-функциональное состояние внутренних органов крыс.

Задачи исследования:

  1. Приготовить и провести стандартизацию суспензии наноразмерных частиц магнетита для внутривенного введения.
  2. Провести скрининговое морфологическое исследование внутренних органов крыс после однократного (100 мг(Fe3O4)/кгмассы тела) и многократного (от 300 мг(Fe3O4)/кгмассы тела до 2 г(Fe3O4)/кгмассы тела) внутривенного введения суспензии наноразмерных частиц магнетита.
  3. Изучить влияние наноразмерных частиц магнетита на морфо-функциональное состояние печени, сердца и почек крыс в различные сроки после однократного и многократного (от 3 до 20 инъекций) внутривенного введения суспензии наноразмерного магнетита.
  4. Оценить динамику изменений активности органоспецифичных ферментов и концентрации метаболитов, отражающих функциональное состояние печени, сердца и почек.
  5. Определить влияние наноразмерных частиц магнетита на состояние про- и антиоксидантной систем плазмы крови крыс после их внутривенного введения.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка эффектов внутривенного введения немодифицированных НЧМ в эксперименте. Впервые выявлен комплекс морфологических и биохимических изменений, обусловленных внутривенным введением наноразмерного магнетита. Установлено, что частицы магнетита накапливаются в клетках системы мононуклеарных фагоцитов печени, легкого, селезенки, почек и сердца крыс, вызывая комплекс морфологических изменений (дисциркуляторные расстройства, моноцеллюлярные некрозы). Впервые проведен ультаструктурный анализ печени после внутривенного введения суспензии НЧМ. Продемонстрировано отсутствие проникновения частиц магнетита в головной мозг. Установлено изменение активности внутриклеточных ферментов гепатоцитов, кардиомиоцитов и нефроцитов при внутривенном введении суспензии НЧМ. Показано влияние наноразмерных частиц магнетита на активность органоспецифичных ферментов и метаболитов плазмы крови крыс. Впервые изучены окислительные свойства НЧМ и его влияние на активность антиоксидантных систем плазмы крови. Показана зависимость выраженности морфологических и биохимических изменений в организме крыс от дозы введенного магнетита.



Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые данные фундаментального характера, раскрывающие морфологические и биохимические аспекты взаимодействия наноразмерных частиц магнетита с тканями и органами крыс.

Отсутствие гибели животных, характер обнаруженных в изученных органах изменений, развитие компенсаторно-приспособительных реакций в ответ на внутривенное введение наноразмерного магнетита свидетельствует о принципиальной возможности использования наноразмерного магнетита в биомедицинских целях и открывает перспективы для создания на его основе новых лекарственных и диагностических средств. На основании результатов работы возможна разработка стратегии по преодолению или снижению повреждающего действия наноразмерных частиц магнетита на организм. Полученные данные расширяют существующие представления о токсичности нанодисперсных материалов для организма экспериментального животного.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Для стабилизации суспензии немодифицированного наноразмерного

магнетита в биологических и медицинских целях пригоден водно-солевой раствор цитрата натрия, хлорида натрия и динатриевой соли 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфониевой кислоты.

  1. Внутривенное введение суспензии наноразмерного магнетита вызывает

морфологические изменения в печени, легком, почках, сердце и селезенке крыс.

  1. Внутривенное введение суспензии наноразмерного магнетита вызывает

изменение активности внутриклеточных ферментов гепатоцитов, кардиомиоцитов и нефроцитов крыс, а также активности ряда органоспецифичных ферментов, метаболитов и общей антиоксидантной активности плазмы крови крыс.

Апробация диссертации. Основные результаты работы доложены и обсуждены на IХ конгрессе международной ассоциации морфологов (г. Бухара, 2008); Х конгрессе с международным участием молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2009); 9-ой школе молодых ученых «Физические проблемы наноэлектроники, нанотехнологий и микросистем» (г. Ульяновск, 2009); на научной конференции «Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (г. Новосибирск, 2009); VI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России (г. Саратов, 2009).

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре морфологии и общей патологии, биохимии и молекулярной биологии, а также патологической анатомии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, 6 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 216 источника, из которых 78 отечественных и 138 зарубежных. Работа иллюстрирована 59 рисунками, 10 таблицами.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на 95 беспородных крысах-самцах, массой 150±30 г, из которых были сформированы 4 группы: 1-я группа (25 крыс) – интактные животные - In; 2-я группа (25 крыс) – контрольная – многократное введение стабилизирующего раствора – в хвостовую вену каждые двое суток вводили по 2 мл стабилизирующего раствора - SS; 3-я группа (25 крыс) – однократное введение суспензии магнетита – в хвостовую вену было введено 2 мл стандартизированной суспензии магнетита (0,1 г(Fe3O4)/кгмассы тела) - NPU; 4-я группа (20 крыс) – многократное введение cуспензии магнетита – в хвостовую вену крыс каждые двое суток вводили по 2 мл стабилизированной суспензии магнетита (0,1 г(Fe3O4)/кгмассы тела) - NPR.

Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1987 г) [Горбунова Н.А., 1998] и Федерального Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.

Из НЧМ готовили суспензию в водно-солевом стабилизирующем растворе, содержащем хлорид натрия, цитрат натрия и динатриевую соль 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфониевой кислоты. Полученную суспензию подвергали сонификации и центрифугированию, после чего супернатант фильтровали через поликарбонатные фильтры с размером пор 100 нм под избыточным давлением аргона [Yang Z. M. et al., 2007; Gu H.W. et al., 2005].

Концентрацию магнетита в суспензии устанавливали по концентрации железа рентгено-флуоресцентным методом. Распределение частиц магнетита по размерам в суспензии устанавливали методом лазерной дифракции. Форму и структуру частиц в суспензии определяли с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.





Томографическое исследование внутренних органов крыс проводили на МРТ-сканере Toshiba Vantage с индукцией поля 1,5Т и на МРТ-сканере Magnetom Open с индукцией поля 0,2Т на 1 и 40 сутки после однократного введения, а также на 40 сутки после многократного внутривенного введения суспензии НЧМ.

Проводку и заливку в парафин материала для гистологического и гистохимического исследований осуществляли по Меркулову [Mеркулов Г.А., 1972]. С целью идентификации в тканях ионов Fe(III), которые входят в состав НЧМ, использовали гистохимическую реакцию с ферроцианидом калия - метод Перлса [Пирс Э., 1962]. Срезы окрашивались по методу Перлса, после чего докрашивались гематоксилином и эозином по Саркисову [Саркисов В.М., 2002]. На гистологических препаратах печени и легкого подсчитывали общее количество Перлс-позитивных макрофагов, с последующим пересчетом на 1 мм2 ткани соответствующего органа [Автандилов Г.Г., 1990]. Гистоэнзимологическое исследование активности сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, НАДН2- и НАДФН2-тетразолий редуктаз в гепатоцитах, нефроцитах и кардиомиоцитах крыс проводили в соответствии с рекомендациями З. Лойды и соавт. [Лойда З. и др., 1982; James J., 1986]. Гистохимическое выявление гликогена в гепатоцитах и кардиомиоцитах производили путем постановки ШИК (PAS)-реакции по МакМанусу и Хочкиссу (контроль с амилазой) [Суходоло И.В., 1990; Кудрявцев Б.Н., 1979].

Количественную оценку активности ферментов и содержания гликогена производили на микроскопе ЛЮМАМ-ИЗ в проходящем свете, длина волны 546 нм и 590 нм, соответственно, зонд площадью 0,5 мкм2. Оптическую плотность измеряли не менее чем в 50 клетках препарата и выражали в условных единицах оптической плотности.

Электронномикроскопическое исследование печени крыс проводили на 1 и 40 сутки после однократного (0,1г(Fe3O4)/кгмассы тела) внутривенного введения (3-я группа, NPU), а также на 40 сутки (суммарная доза 2г(Fe3O4)/кгмассы тела) у животных с многократным внутривенным введением суспензии НЧМ (4-я группа, NPR). Фрагменты печени (V1мм3) фиксировали в 4% параформальдегиде на буфере Хэнкса (рН 7,4) в течение 24 ч при 4С, затем в 1% OsO4 на том же буфере в течение 3 ч при 4С. Обезвоживали и заливали в смесь эпон-аралдит. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм окрашивали 1% раствором толуидинового синего в насыщенном растворе буры [Уикли Б., 1975]. Ультратонкие срезы помещали на сетки, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, после чего просматривали на электронном микроскопе JEM-100 CX II, JEOL и фотографировали при увеличении 3600, 7200 и 48000.

В плазме крови определяли активность ряда органоспецифичных ферментов: аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), -глутамилтрансферазы (-ГТ), креатинфосфокиназы (КФК), креатинфосфокиназы МВ (КФК-МВ) лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гидроксибутиратдегидрогеназы (ГБДГ), а также концентрацию мочевины, креатинина, общего и прямого билирубина на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi-911 с использованием реактивов фирм: «Вектор-БЕСТ», «Biocon», «Chronolab», «СKNAC-activated».

Содержание радикалов в плазме крови животных и общую антиоксидантную активность плазмы определяли хемилюминесцентным методом с помощью полуавтоматического люминометра (Lumat LB 9507). Об общей антиоксидантной активности плазмы крови крыс судили по снижению интенсивности люминол-зависимой хемилюминисценции в пробе через 1 минуту относительно исходных значений хемилюминисценции пробы.

Статистическая обработка результатов производилась с помощью статистического пакета «SPSS 11.5». Результаты представлены в виде средней, ошибки средней и стандартного отклонения (Х±m). Распределение на соответствие нормальному проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилкса. Для выяснения достоверности различий средних значений морфометрических, гистохимических и биохимических показателей между экспериментальными группами, использовали t-тест для независимых выборок (тест Стьюдента) и t-тест для зависимых выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основной проблемой использования наноматериалов в медицинских и биологических исследованиях является получение стабильной суспензии [Gupta A.K. et al., 2005; Арсентьева И.П. и др., 2007]. Проблема подбора стабилизатора еще актуальнее в биологических исследованиях, так как помимо стабилизирующего эффекта его компоненты не должны обладать повреждающим действием на биологические структуры и молекулы [Bruce I.J. et al., 2005; Chan D.C.F. et al., 1993].

Из всех исследованных нами стабилизирующих систем (олеиновая кислота, растительные полисахариды, цитрат натрия, физиологический раствор) для дальнейшего исследования был выбран водно-солевой раствор на основе цитрата натрия, хлорида натрия и динатриевой соли 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфониевой кислоты (ГЭПЭС). Ионы цитрата и хлорида натрия, сорбируясь на поверхности НЧМ, придают им электростатический и стерический факторы стабильности. ГЭПЭС, как компонент стабилизирующего раствора, обеспечивает буферные свойства последнего (рН 7,4) [Левитин Е.Я. и др., 1998; Martina M.S. et al., 2005].

По данным электронной микроскопии отдельные частицы магнетита в приготовленной нами суспензии имеют сферическую форму и располагаются в виде свободных частиц и агломератов. Максимальный размер свободных частиц составляет 30 нм, размер агломератов частиц не превышает 100 нм.

Для выявления эффектов и последствий введения магнетита на организм крыс брали максимально достижимую концентрацию НЧМ. Для данного стабилизирующего раствора и используемых НЧМ концентрация 7 мг(Fe3O4)/мл(стаб. раствора) является максимальной. Дальнейшее увеличение концентрации наноразмерных частиц вызывает снижение седиментационной устойчивости суспензии.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.