WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Динамика клеточных популяций гемоцитов асцидии halocynthia purpurea в ответ на тканевое повреждение

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

СУХАЧЕВ

Александр Николаевич

ДИНАМИКА КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ГЕМОЦИТОВ АСЦИДИИ HALOCYNTHIA PURPUREA В ОТВЕТ НА ТКАНЕВОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ

03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2011

Работа выполнена в Отделе иммунологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Полевщиков Александр Витальевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Атаев Геннадий Леонидович

доктор биологических наук Мазинг Юрий Андреевич

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН

Защита диссертации состоится "____" _______ 2011 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д001.022.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12).

Автореферат разослан " ___ " ____________ 2011 года.

Учёный секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук Дыбан П.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Проблема регенерации уже длительное время является одной из наиболее актуальных проблем клеточной биологии, иммунологии и фундаментальной медицины. Во всем мире идет интенсивное изучение процессов восстановления, что можно объяснить чрезвычайной важностью процессов регенерации для решения многих вопросов теоретической биологии и репаративной медицины (Lopatina T., 2011; Yun Y.R., 2010; Karalaki M., 2009; Бабаева А.Г., 1985; Горышина Е.Н., 1990). При этом способность к регенерации является универсальным свойством всех живых организмов. Однако степень выраженности этой способности у разных групп очень отличается по механизмам, формам и продолжительности. Несмотря на большую актуальность данной проблемы и масштаб исследований, на сегодняшний день нет единого общепринятого подхода к процессу регенерации, и, что не менее важно, к его регуляции. Тем не менее, благодаря использованию современных методов клеточной и молекулярной биологии, биологии развития, иммуногистохимии, клеточные основы репаративного процесса млекопитающих исследуется довольно быстрыми темпами (Karalaki M., 2009; Lopatina T., 2011). В гораздо меньшей степени это пока относится к регуляции репаративных процессов на уровне организма, пока только в общих чертах описано значение нервной и иммунной систем для инициации репаративного процесса (Бабаева А.Г., 1985), а также роль тканеспецифических факторов в ходе репарации. При этом основные исследования направлены на изучение процесса репарации у млекопитающих, обладающих очень сложной системой тканей и многофакторными регуляторными процессами. При этом млекопитающие составляют довольно молодой в филогенетическом плане класс, поэтому его изучение не может в полной мере раскрыть процесс становления механизмов регуляции регенерационных процессов и указать их древние, ключевые, а потому наиболее чувствительные к воздействию точки.

По этой причине представляется актуальным рассмотрение взаимосвязей защитных и репаративных реакций на разных эволюционных уровнях, начиная с самых древних форм, с целью проследить этапы становления комплексной защитно-репаративной реакции, формирование процесса взаимодействия иммунной и репаративной систем в разных таксонах и тем самым взглянуть на проблему в целом. Модель древнейших из ныне живущих низших хордовых животных (асцидии) очень удобна с той точки зрения, что они обладают всеми четырьмя классическими типами тканей, обладают циркуляторной системой, выполняющей как транспортные, так и защитно-репаративные функции, и при этом по общей степени сложности и интегративности тканевых систем существенно уступают млекопитающим. При этом асцидии, как все многоклеточные животные, обладают реакциями врожденного иммунитета и активно защищаются от проникновения патогенов во внутреннюю среду. Одновременно эти организмы обладают и системами репарации и регенерации (Rinkevich Y., 2010; Auger H., 2010; Kawamura K., 2010). При этом вопрос о наличии у асцидий механизмов приобретенного иммунитета остается открытым, однако есть основания предполагать наличие некоторых элементов системы приобретенного иммунитета, первые этапы её формирования (Tomaso A., 2008). Механизмы защитных реакций асцидий имеют много общих черт с реакциями, свойственными большинству беспозвоночных. С другой стороны, некоторые ответные реакции асцидий на введение чужеродных антигенов очень схожи с реакциями врожденного иммунитета позвоночных. Не случайно асцидии являются одним из главных модельных объектов по изучению этапов становления и механизмов аллораспознования, системы распознавания "своё" – "не своё" в целом (Fuke, 2001).

Изучение динамики клеточных популяций очень часто включает глубокий анализ системы циркулирующих форменных элементов. На сегодняшний день разные исследователи выделяют от 3 до 9 различных популяций циркулирующих клеток у асцидий, выделенных как правило с помощью классических гистологических и гистохимических методов исследования (Rowley, 1981; Smith, Peddie, 1992; Shirae, Saito 2000; Parrinello et al., 2007; Hirose еt al., 2003; Parrinello еt al., 2003). Лишь единичные работы предусматривают использование моноклональных антител против поверхностных антигенов и маркеров циркулирующих клеток человека (Cima F., 2006; Khalturin K., 2003). Тем не менее, единая общепризнанная классификация гемоцитов асцидий, основанная на гистогенетических связях, в настоящее время отсутствует. Неясным остается вопрос о способности циркулирующих клеток асцидий к пролиферации, что важно для понимания процесса становления системы стволовых клеток в высших таксонах позвоночных, механизмов их адгезии и миграции в очаг тканевого повреждения.



Цель работы: изучение динамики клеточных популяций асцидии Halocynthia purpurea в ответ на тканевое повреждение.

Задачи работы:

1. На основании морфологического анализа описать основные популяции гемоцитов H.purpurea, предложить их классификацию и изучить функциональные характеристики;

2. Оценить возможность использования и информативность применения метода проточной цитометрии для типирования неокрашенных циркулирующих клеток асцидий;

3. Исследовать способность циркулирующих гемоцитов к пролиферации в ответ на тканевое повреждение;

4. Изучить динамику клеточных популяций и экспрессии ими поверхностных маркеров в ответ на тканевое повреждение.

Научная новизна. Впервые проведено исследование различных популяций гемоцитов асцидии H.purpurea с применением методов проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Выявлена способность морулярных клеток к автофлуоресценции, что может служить основным критерием оценки относительного содержания клеток данной популяции в гемолимфе. С использованием двух методов оценки впервые показан факт пролиферации циркулирующих клеток асцидий в норме и в ответ на тканевое повреждение. Для исследования циркулирующих клеток беспозвоночных впервые были использованы трехпараметрические гистограммы, что позволило оценить клеточный состав гемолимфы и её отдельных фракций. Впервые была проведена оценка возможности использования моноклональных антител к адгезионным молекулам для типирования гемоцитов в норме и в ответ на тканевое повреждение.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Основным научным значением работы является важный теоретический результат, описывающий динамику и кинетику клеточных популяций асцидий в ответ на тканевое повржедение. Полученные результаты свидетельствуют о наличии у низших хордовых циркулирующих клеток-предшественников, способных к пролиферации и дифференцировке в различные морфотипы гемоцитов асцидий. Полученные новые данные о морфологии гемоцитов асцидий и экспрессии их поверхностных маркеров, обладающих антигенным перекрестом с ключевыми адгезионными молекулами стволовых клеток млекопитающих. Существенным теоретическим и практическим результатом является адаптация метода проточной цитометрии для изучения циркулирующих клеток беспозвоночных без использования моноклональных антител.

Полученные результаты найдут применение в фундаментальных сравнительно-гистологических и сравнительно-иммунологических исследованиях, в биологии стволовых клеток, в лекционных курсах по общей и сравнительной иммунологии, сравнительной гистологии и другим дисциплинам. Методические разработки могут быть использованы для изучения защитных реакций различных таксонов беспозвоночных и позвоночных животных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Определены основные популяции циркулирующих клеток асцидии H.purpurea.

2. Циркулирующие гемоциты асцидии способны к пролиферации и отвечают повышением её уровня на тканевое повреждение.

3. Функциональная активность циркулирующих клеток асцидий (способность к эндоцитозу, продукции активных форм кислорода, синтезу цитокино-подобных факторов) меняется в ответ на тканевое повреждение.

4. Моноклональные антитела к адгезионным молекулам человека связываются с перекрестно-реагирующими детерминантами гемоцитов асцидий; уровень связывания меняется в ответ на травму.

Реализация работы. Результаты работы легли в основу 3 статей и 7 тезисов докладов.

Личный вклад в проведенное исследование. Личный вклад автора в выполненную работу включал самостоятельное проведение большинства исследований, разработку и адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов. Вклад соавторов ограничивался помощью в постановке и освоению новых методов исследования, технической поддержке при работе с аппаратурой и предоставлением в распоряжение автора ряда реактивов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008), Всероссийской симпозиуме по биологии клетки в культуре на тему "Культивируемые клетки как основа клеточных технологий" (Санкт-Петербург, 2009), Международной научной конференции "Молодь – медицинi майбутнього" (Одесса, 2010), совместном заседании отделов иммунологии и общей и частной морфологии НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2011).





Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов. Работы проиллюстрированы 47 рисунками и фотографиями и 10 таблицами. Библиографический указатель содержит 154 работы, в том числе 20 работ на русском языке и 134 – на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Исследования проведены на асцидии Halocynthia purpurea (Urochordata; Ascidiacea; Stolidobranchia; Pyuridae; Halocynthia). Сбор экспериментальных животных производили на базе морской биологической станции «Восток» Института биологии моря им.А.В.Жирмунского ДВО РАН. Животных содержали в аэрируемых аквариумах при естественной температуре и освещенности.

Фракционирование гемоцитов асцидии проводили при помощи ступенчатого (30, 25, 20 и 10%) градиента диатризоата натрия (ДН). Для получения фракций гемоцитов клеточную суспензию в объеме 1 мл наносили на охлаждённые до 0°С фазы ДН и центрифугировали 10 мин при 200 g. Клетки полученных фракций отмывали охлажденным раствором Дальбекко без Ca2+ и Mg2+ с содержанием NaCl равным 34 г/л в течение 5 мин при 100g и использовали в дальнейшей работе.

Оценка кислородного метаболизма гемоцитов асцидии. Продукцию супероксиданиона О2 оценивали с помощью автоматизированной модификации НСТ теста в спонтанной и индуцированной модификациях (Полевщиков А.В., Киселева Е.П., 1994). В качестве стимуляторов использовали 0,2% суспензию зимозана в фильтрованной морской воде (ФМВ), 0,2% суспензию латексовых микробус в ФМВ или раствор ЛПС S.typhimurium (50 мкг/мл) на ФМВ. Результат выражали в единицах ОП на 2105 гемоцитов.

Оценка влияния лектинов на способность гемоцитов к поглощению нейтрального красного. Разработка и адаптация к новому объекту метода автоматизированного учета поглощения нейтрального красного была произведена на основе работ (Borenfreund E., Puerner J.A., 1984) и (Hauton C., Smith V.J., 2004). Результат выражали в единицах ОП на 2105 гемоцитов.

Определение гемагглютинирующей активности гемолимфы. Титры гемагглютининов оценивали в реакции гемагглютинации по общепринятой методике (Фримель Г. 1987). Реакцию оценивали визуально. Результат реакции выражали в виде титра, равного –log2Х, где Х – последнее разведение целомической жидкости, обеспечивавшее формирование типичного агглютината. Для эксперимента использовались следующие лектины: WGA, SBA, PSA, SNA, STA, SRA, LCA, LAL, RPA.

Исследование динамики клеточных популяций в ходе репаративных процессов. Моделью тканевого повреждения было нанесение стандартизированного надреза туники и подлежащих тканей, включая стенку синуса. Длина надреза составляла 1 см при глубине 0,5 см. Во время первого повреждения туники одновременно производили забор гемолимфы (точка 0 ч, контроль) от каждой асцидии. Для изучения динамики популяций циркулирующих клеток через 24 ч повторно надрезали асцидию и осуществляли забор гемолимфы. Посчитанные клетки (5 млн) фиксировали охлажденным до 4°С формалином и хранили до использования. Исследование образцов проводили на базе Дальневосточного Государственного Университета (г. Владивосток) на проточном цитометре FACSCalibur™ (Becton Dickinson, США), используя лицензированное программное обеспечение CellQuest Pro. При анализе популяций гемоцитов использовали следующие цитометрические параметры: FS – прямое светорассеивание, отражающее размеры клеток, SS – боковое светорассеивание, отражающее структуру клеток и неоднородность цитоплазмы и канал PMT2 показывающий уровень автофлуоресценции. Каждый образец оценивали по 40000 событиям (клеткам). В ходе процедуры анализа устанавливали соответствующие пороговые значения для исключения из анализа меньших по размеру частиц дебриса и отдельных гранул.

Оценка пролиферативной активности гемоцитов с помощью метода проточной цитометрии. Гемолимфу с клетками получали на сроках 0, 24 и 48 ч после первого повреждения. Для оценки пролиферативной активности использовали следующие красители: йодистый пропидий (PI) и антитела к белку Ki-67 (Сибиряк С.В, 2008). При анализе на проточном цитометре FACSCaliburTM результаты обобщали по 10000 клеток, отобранных по размерам и гранулярности. Обработку полученных данных проводили, используя программное обеспечение ModFit LT 3.0TM.

В случае окраски антителами к Ki-67 к пермеабилизированным клеткам добавляли 5 мкл антител и инкубировали в течение 1 ч. Результаты флуоресценции обобщали по 10000 клеток, отобранных по размерам и гранулярности, используя проточный цитометр FACSCaliburTM. Обработку полученных данных проводили, используя программное обеспечение CellQuest Pro.

Оценка связывания моноклональных антител к адгезионным молекулам человека с гемоцитами асцидий. Уровень связывания антител определяли на точках 0 и 24 ч с момента тканевого повреждения. Для оценки использовали мышиные моноклональные антитела к CD166, CD117, CD29, CD34, CD15, CD54, CD62L, CD62P, CD90, CD94 человека, меченые аллофикоцианином. Изотипическим контролем служил иммуноглобулин MOPC-21 мыши (все реагенты BD Biosciences, США).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.