WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Взаимодействие культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных и иммунокомпетентных клеток человека при разном содержании кислорода

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ГОРНОСТАЕВА АЛЕКСАНДРА НИКОЛАЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАЗНОМ СОДЕРЖАНИИ КИСЛОРОДА

03.03.01 - физиология 

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН Болтовская Марина Николаевна
кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории метаболизма и иммунитета ГНЦ-РФ ИМБП РАН Рыкова Марина Петровна

Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 20 марта 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Автореферат разослан ____ февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) – это малодифференцированные стромальные предшественники, обладающие такими уникальными свойствами как высокая пролиферативная и паракринная активность, способность к мультилинейной дифференцировке (Friedenstein A.J. et al., 1991; Caplan A.I., 1991; Horwitz E.M. et al., 2005). Благодаря этому ММСК обеспечивают замену клеток, погибших естественным путем, и регенерацию поврежденных тканей, а также играют важную роль в поддержании гомеостаза, в частности, формируя гемопоэтическое микроокружение.

Обнаруженная сравнительно недавно способность ММСК модулировать ответ как аутологичных, так и аллогенных иммунных клеток (Bartholomew A. et al., 2002; Le Blanc K. et al., 2004; Rasmusson I. et al., 2003) открывает перспективы для использования мезенхимальных предшественников в терапии аутоиммунных заболеваний и подавлении реакции отторжения трансплантата. Проведены успешные клинические испытания ММСК при лечении болезни Крона, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, системной склеродермии (Иванюк Д.И. и др., 2011; Kaplan J.M. et al., 2011). Продемонстрированы положительные результаты при применении ММСК у пациентов с острой реакцией «трансплантат против хозяина» и невосприимчивостью к стероидам (Le Blanc K. et al., 2008; Gonzalo-Daganzo R. et al., 2009).

В настоящее время активно изучаются механизмы реализации иммуномодуляторных свойств ММСК. Показано их влияние практически на все типы иммунных клеток in vitro: подавление пролиферативной активности Т-, В-клеток и ЕК, замедление созревания ДК, увеличение доли Т-хелперов и регуляторных ДК, снижение цитотоксичности ЕК и CD3+/CD8+ клеток, существенное изменение цитокинового профиля иммуноцитов (Glennie S. et al., 2005; Uccelli A. et al., 2006; Сергеев В.С. 2005). Иммуномодуляторное воздействие ММСК реализуется как через паракринные механизмы, так и посредством физических контактов между клетками, и обусловлено многими факторами, такими как время сокультивирования, соотношение ММСК/лимфоциты, наличие провоспалительных стимулов, микроокружение (Augello A. et al., 2005; Maccario R. et al., 2005; Puissant B. et al., 2005; McIntosh K. et al., 2006; Corcione A. et al., 2006; Spaggiari G.M. et al., 2006; Ramasamy R. et al., 2008; Magin A.S. et al., 2009; Буравкова Л.Б. и Андреева Е.Р., 2010; Рубцов Ю.П., 2012).

Одним из важных физических факторов микроокружения является парциальное давление О2. Исследования взаимодействия ММСК и мононуклеаров периферической крови (МНК) in vitro ведутся, как правило, при атмосферной концентрации кислорода (20%), хотя, как известно, тканевые ниши ММСК характеризуются пониженным содержанием О2 (1-7%). Показано, что in vitro низкое парциальное давление кислорода существенно модифицирует свойства стромальных клеток, в частности, увеличивает их пролиферативную активность и число КОЕ-Ф, замедляет дифференцировку в остео- и адипогенном направлении, а в хондрогенном - усиливает (Grayson W.L. et al 2007; Fehrer С. et al., 2007; Nekanti U. et al., 2010; Буравкова Л.Б. и др., 2009, 2010, 2012). Вопрос о влиянии напряжения кислорода на иммуномодуляторные свойства ММСК практически не изучен, тогда как пониженная концентрация кислорода характерна для тканей организма (предполагаемого места взаимодействия ММСК и лимфоцитов), и эксперименты, проведенные при таком напряжении кислорода, будут более приближенными к условиям in vivo.



Получение данных об иммуномодулирующих свойствах ММСК при пониженном содержании кислорода позволит существенным образом расширить представления о механизмах взаимодействия стромальных и иммунокомпетентных клеток и внести значительный вклад в развитие фундаментальных и прикладных исследований в области клеточной физиологии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение иммуномодуляторных эффектов ММСК из жировой ткани человека in vitro в условиях гипоксии.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи – в стандартных условиях (20% О2) и при пониженной концентрации кислорода (5% О2) оценить:

1) влияние ММСК на жизнеспособность неактивированных и активированных митогеном мононуклеаров периферической крови человека (МНК);

2) активацию и субпопуляционный состав МНК при взаимодействии с ММСК;

3) воздействие ММСК на пролиферативную активность МНК;

4) цитокиновый профиль МНК при сокультивировании с ММСК;

5) вклад прямых контактов «клетка-клетка» и паракринной регуляции в реализацию иммуномодуляторных эффектов ММСК.

Научная новизна

Впервые показано, что гипоксия модифицирует иммуномодуляторные свойства ММСК, приводя в большинстве случаев к усилению супрессивного эффекта. Установлено, что выраженность иммуносупрессивного эффекта зависит от фазы роста ММСК: при взаимодействии лимфоцитов с пролиферирующими ММСК происходит усиление иммуносупрессивного эффекта. Изменение иммуномодуляторных свойств стромальных предшественников при гипоксии зависит от наличия/отсутствия контакта между клетками и фазы роста ММСК. Впервые обнаружен сдвиг цитокинового профиля в кондиционированной среде при сокультивировании ММСК и МНК в сторону противовоспалительного при пониженном содержании кислорода.

Теоретическая и практическая значимость работы

Установлено, что in vitro аллогенные ММСК способны эффективно осуществлять иммуносупрессию при различном напряжении О2, в том числе и при пониженном (близком к значениям в тканях организма). Разработаны способы сокультивирования для анализа иммуномодуляторных эффектов ММСК в различном функциональном состоянии (log-фаза/фаза плато). Выявлена зависимость иммуносупрессивных свойств ММСК от их пролиферативной активности. Полученные результаты вносят существенный вклад в представление о том, как будут реализовываться иммуномодуляторные свойства ММСК в условиях, приближенных к физиологическим. Обнаружены индивидуальные отличия иммуносупрессивных эффектов ММСК в зависимости от донора лимфоцитов. На основании полученных данных можно заключить, что введению ММСК in vivo должны предшествовать эксперименты по взаимодействию клеток возможного донора и реципиента in vitro, которые следует проводить при пониженном содержании кислорода.

Положения, выносимые на защиту

1. ММСК обладают выраженными иммуносупрессивными свойствами, которые сохраняются и могут усиливаться при пониженном содержании кислорода

2. Иммуномодулирующие эффекты ММСК зависят от их фазы роста: ММСК в log-фазе обладают достоверно более выраженным антипролиферативным эффектом.

3. При отсутствии клеточного контакта с МНК иммуносупрессивные эффекты ММСК сохраняются, однако при его наличии противовоспалительное изменение цитокинового профиля выражено сильнее.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010 г.), IX, Х и XI Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва. 2010, 2011, 2012 г.), Всероссийской научной школе молодых ученых, преподавателей, аспирантов, специалистов “Биомедицинская инженерия” (Санкт-Петербург, 2010 г.), III и IV всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва 2010, 2011 г.), III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012 г.), VII международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2011 г.), Шестой Российской конференции с международным участием: «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011 г.), The World Conference on Regenerative Medicine (Germany, Leipzig, 2011).

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ, 2 статьи в сборниках, 9 тезисов докладов.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук» 24.10.2012 г.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при поддержке программ ОБН РАН и ОФФМ РАН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 121 странице, содержит 26 рисунков и 15 таблиц. Список литературы состоит из 185 цитируемых источников, из которых 20 - на русском и 165 - на иностранном языке.





ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

ММСК выделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека по стандартной методике (Zuk P. et al. 2001) с нашими модификациями (Буравкова Л. Б. и др., 2009) и культивировали в среде -MEM, с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, HyClone, США), 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия), и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco, США) в условиях 5% СО2, 37оС, 100% влажности при 20% и 5% кислорода. Для экспериментов использовали клетки 2-4 пассажей.

МНК выделяли из периферической крови здоровых добровольцев на градиенте плотности (=1,077, Гистопак, Sigma–Aldrich, США) согласно инструкции производителя. Для каждого донора был определен субпопуляционный состав лимфоцитов, показатели которого находились в пределах клинической нормы. Выделенные клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Биолот, Россия) с 2 мМ L-глутамина; 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco, США), 5% инактивированной ЭТС. Для активации Т-клеток в среду добавляли фитогемагглютинин (ФГА) (Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл.

Сокультивирование МНК и ММСК проводили в трех вариантах: «монослой», «трансвелл» и «смешанная культура», (рис. 1). В вариантах «монослой» и «трансвелл» МНК сокультивировали с ММСК, достигшими 80% конфлуентности и прошедшими фазу активного деления. В первом случае МНК физически контактировали с ММСК. Во втором варианте, чтобы исключить клеточный контакт, ММСК и МНК разделяли полупроницаемой мембраной-вставкой «трансвелл» (диаметр пор 0,4 мкм) (Costar, США). «Смешанная культура» представляла собой измененную классическую модель взаимодействия лимфоцитов донора и реципиента «смешанная культура лимфоцитов» (СКЛ). В модифицированной нами модели СКЛ в качестве клеток-индукторов использовали не аллогенные МНК, а суспензию аллогенных ММСК. В этом варианте взаимодействие МНК и ММСК начиналось одновременно с их адгезией к пластику и последующей активной пролиферацией. Таким образом, в экспериментах использовали стромальные предшественники, находившиеся в разном физиологическом состоянии. В вариантах «монослой» и «трансвелл» ММСК были в предмонослое и практически не делились, находясь на плато кривой роста, а в смешанной культуре – клетки активно пролиферировали (Lоg-фаза или фаза экспоненциального роста). Каждый эксперимент воспроизводился 4-7 раз с дублированием аналитических измерений.

 Структура исследования Клетки культивировали 72 часа при 20% и 5%-0

Рис. 1. Структура исследования

Клетки культивировали 72 часа при 20% и 5% О2, после чего методом проточной цитофлуориметрии (EPICS XL, Beckman Coulter; FACS Calibur, Becton Diсkinson, США) определяли:

  • Пролиферативную активность МНК с помощью 5,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидил эфира (CFSE, Invitrogen, США) – внутриклеточного ковалентно связывающегося красителя. МНК окрашивали CFSE (5 мкМ/мл) по стандартной методике (Suva D. et al., 2007), затем клетки культивировали в монокультуре или с ММСК;
  • Субпопуляционный состав и активацию МНК с помощью окрашивания антителами против CD3, CD69, CD45/CD14, CD3/СD19, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/16+56, СD3/HLA-DR, СD3/CD25, CD90, CD105, CD73, мечеными FITC и PE, использовали соответствующий изотипический контроль IgG (Immunotec (Франция);
  • Жизнеспособность МНК, используя набор AnnexinV-FITC/PI (Immunotec (Франция);
  • Содержание цитокинов в среде культивирования с помощью набора FlowCytomix human Th1/Th2 11 Plex (Bender MedSystems, Австрия), который позволяет выявлять в образцах содержание 11 цитокинов (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IFN-, TNF-, TNF-) одновременно.

Морфологический анализ. Для выявления поверхностных антигенов МНК окрашивали живые клетки, внутриклеточных – фиксированные ледяным метанолом. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica DM5000B, Германия). Также совместно в профессором С.В.Буравковым на базе Института морфологии человека РАМН использовали электронную сканирующую (СЭМ) (S-500, Hitachi, Япония) и дифференциальную интерференционную микроскопию (DIC) (Olympus IX81, Япония).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы “Statistica 7.0” для WinXP. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (уровень значимости p=0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологическая характеристика МНК, сокультивируемых с ММСК при различной концентрации кислорода

После 72 часов сокультивирования ФГА-МНК прочно адгезировали к ММСК, как при 20%, так и при 5% О2, в случае неактивированных МНК такие клетки были единичны. С помощью DIC и СЭМ показано, что активированные МНК не только прикреплялись к ММСК, но распластывались на них и трансмигрировали в субстромальное пространство (рис. 2а,б,в). ФГА-МНК, расположенные на ММСК группами и поодиночке, имели многочисленные микроскладки на поверхности, что свидетельствовало об их активации и взаимодействовали со стромальными клетками с помощью отростков (рис. 2б,в).

Прикрепившиеся ФГА-МНК экспрессировали общий лейкоцитарный антиген СD45, большинство из них были СD3-положительными. Идентифицированы СD14+-моноциты, часть из которых имела антиген макрофагов провоспалительного фенотипа СD68, также были обнаружены СD206+моноциты (антиген макрофагов антивоспалительного фенотипа).

 Взаимодействие МНК и ММСК. а. ФГА-МНК (черные стрелки), прикрепляются-1



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.