WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов цнс в эксперименте

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КОНИЕВА АЛИНА АЛАНБЕКОВНА

Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

академик РАМН, профессор Владимир Никитич Ярыгин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Татьяна Клеониковна Дубовая

доктор медицинских наук, профессор Сергей Андреевич Гусев

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится «27» сентября 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «7» июля 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор А.И. Щёголев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клеточная терапия в настоящее время рассматривается как перспективный и многообещающий метод лечения тяжелых заболеваний. Среди них важное место занимают цереброваскулярные и травматические поражения ЦНС, создающие острую медико-социальную проблему, наносящую огромный экономический ущерб обществу. Инсульт, как наиболее частая форма острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК), ежегодно в мире поражает от 5,6 до 6,6 млн человек. В течение первого года смертность от инсульта составляет около 50% заболевших. Инсульт является основной причиной инвалидизации больных, т.к. у 80% выживших имеются ограничения трудоспособности в связи с сохраняющимися двигательными нарушениями. Более того, за последнее десятилетие наметилась тенденция к «омоложению» инсульта. Так, в последние годы не менее 20% ОНМК диагностируется у лиц трудоспособного возраста. Это делает рассматриваемую патологию общественно значимой.

Травматическая болезнь спинного мозга (ТБСМ) приобрела чрезвычайную актуальность в связи с ростом технического прогресса, что привело к резкому увеличению частоты травматических поражений позвоночника и спинного мозга. По данным ВОЗ число больных с поражением спинного мозга составляет около 30 человек на 100 000 населения. В России численность больных с последствиями ТБСМ составляет порядка 8 тысяч человек. При этом зачастую пострадавшими являются социально-активные, работоспособные люди. В подавляющем большинстве случаев последствием тяжелых повреждений спинного мозга является инвалидизация пациентов, что ведет за собой стойкую утрату трудоспособности и, как следствие, значительные социальные и экономические потери.

Существующие на сегодняшний день протоколы нейрохирургической коррекции и медикаментозной терапии цереброваскулярных заболеваний и травматических повреждений не способны обеспечить полное восстановление структуры и функции ЦНС и направлены лишь на предотвращение гибели нейронов, окружающих очаг поражения, развивающейся вследствие запуска каскада патобиохимических реакций. Многочисленные экспериментальные исследования возможностей клеточной терапии в лечении данных заболеваний внушают большие надежды. В связи с этим, использование возможностей регенеративной медицины и, в частности, клеточной терапии как методов, стимулирующих структурно-функциональное восстановление ЦНС, является чрезвычайно актуальным, а дальнейшее исследование механизмов действия стволовых клеток приобретает особую научно-практическую значимость.

Цель исследования: изучение влияния экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на восстановительные процессы в условиях экспериментального ишемического инсульта и спинальной травмы; исследование распределения трансплантированных клеток в организме животных.

Задачи исследования:

  1. Разработать метод эффективного мечения мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека магнитными флуоресцентными микросферами и проанализировать влияние этих микрочастиц на физиологические функции клеток in vitro;
  2. Изучить распределение меченых человеческих МСК после интраспинальной трансплантации животным с травмой спинного мозга;
  3. Изучить распределение меченых человеческих МСК после внутривенной трансплантации животным с экспериментальным ишемическим инсультом;
  4. Оценить эффективность действия трансплантированных человеческих МСК на восстановление локомоторных функций по шкале BMS у мышей после травмы спинного мозга;
  5. Оценить неврологический статус крыс с экспериментальным ишемическим инсультом после трансплантации человеческих МСК в тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт»;
  6. Методом магнитно-резонансной томографии проследить за динамикой изменения очага ишемии в головном мозге крыс после трансплантации человеческих МСК;
  7. Охарактеризовать клеточные механизмы действия МСК после их трансплантации мышам с травмой спинного мозга и крысам с ишемическим инсультом.

Научная новизна. Подобрана методика эффективного мечения мезенхимальных стволовых клеток магнитными флуоресцентными микрочастицами, что позволило визуализировать МСК после трансплантации животным как прижизненно, с помощью МРТ, так и постмортально, с использованием флуоресцентной микроскопии. Детально изучены возможные нежелательные эффекты этих частиц на функциональное состояние клеток в культуре.



Впервые изучены механизмы действия мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека, на эндоваскулярной модели инсульта у крыс и на модели позвоночно-спинномозговой травмы у мышей. Показано восстановление неврологического дефицита у животных в обоих случаях повреждения ЦНС после трансплантации человеческих плацентарных клеток. Впервые выявлена миграция меченых клеток в гиппокамп обоих полушарий мозга, как при инсульте, так и при спинальной травме. Также установлен факт дифференцировки МСК плаценты человека в нейрональном направлении после трансплантации грызунам с моделью инсульта и спинальной травмы.

При помощи МРТ показано достоверное уменьшение очага ишемии у опытных крыс, по сравнению с контрольными животными. Впервые была показана временная характеристика распределения меченых клеток в организме крыс с инсультом, свидетельствующая о том, что МСК проникают в мозг через сосуды, вокруг которых концентрируются в течение первых 7 дней. Затем происходит их миграция в зону ишемии, где они достигают максимальной концентрации к концу 3 недели. Впервые определена стимуляция эндогенного нейрогенеза под влиянием трансплантации МСК, выделенных из плаценты человека, у крыс с ишемией головного мозга.

Практическая значимость. Результаты исследования позволяют расширить и дополнить существующие представления о клеточной терапии заболеваний центральной нервной системы. Данная работа является частью обширных доклинических исследований терапии цереброваскулярных заболеваний и травматических поражений спинного мозга и вносит определенный вклад в подготовку клинических испытаний и, в дальнейшем, внедрения в практическую медицину. Активное изучение механизмов действия МСК в доклиническом формате является залогом эффективного и безопасного применения их в будущем.

Внедрение в практику. Методические рекомендации по выделению мезенхимальных стволовых клеток из экстраэмбриональных органов, их культивированию и дифференицровке в условиях in vitro использованы при выполнении научной работы в группе липидных модуляторов иммунитета отдела иммунологии ИБХ РАН, а методические рекомендации по мечению МСК плаценты человека внедрены в практику лаборатории клеточной биологии ИБМХ им. В.Н.Ореховича.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 9-м международном семинаре по магнитному резонансу (г. Ростов-на-Дону, 2008), на научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (г. Москва, 2008), на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (г. Москва, 2008), на 6-м Всемирном конгрессе по инсульту (г. Вена, 2009), на 2-ой ежегодной европейской конференции «Stem Cells & Regenerative Medicine» (г. Эдинбург, 2009), на российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение» (г. Пятигорск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 243 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из плаценты человека. Выделение МСК из тканей плаценты человека производили ферментативным способом. Для получения клеток использовали фрагмент ткани плаценты после нормальных родов вблизи пупочного канатика. После промывания его раствором Хэнкса (ПанЭко, РФ), содержащим антибиотики, и механического воздействия, полученную взвесь инкубировали в 0,1%-ном растворе коллагеназы Iго типа (Gibco, США) в течение 30 мин при 37°C. По окончании инкубации суспензию отмывали раствором Хэнкса (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендировали в DMEM-F12 (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, США), 100 мкг/мл стрептомицина, 100 U/мл пенициллина, 2 мМ L-глютамина (все – Gibco, США), и суспензию помещали в культуральные флаконы (площадью 75 см2 с фильтром (Greiner, Германия)). Культивирование проводили в СО2инкубаторе со следующими параметрами: 37 С, 5 % СО2, 80 % влажности. При достижении 80-90% конфлюентности, клетки снимали с пластика раствором трипсина-версена (ПанЭко, РФ) (в соотношении 1:1) и рассаживали в концентрации 2,5105клеток/флакон. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.





Мечение МСК магнитными флуоресцентными микрочастицами. Для мечения МСК использовали магнитные флуоресцентные (ex = 480 нм, em = 520 нм) микрочастицы диаметром 0,96 мкм (Bangs lab. Inc., США). По достижении 80-90% конфлюентности к культуре МСК добавляли суспензию частиц (5 мкл стоковой суспензии на 1 мл культуральной среды). Клетки инкубировали с частицами 24 часа в СО2-инкубаторе. Эффективность мечения оценивали на проточном цитофлуориметре EPICS Coulter XL. Для каждого образца регистрировали не менее 1х104 событий. Обработку полученных результатов проводили в программе WinMDI.

Оценка уровня пролиферации МСК, меченых магнитными микрочастицами. МСК культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах (1000 клеток на лунку) с последовательными разведениями частиц (от 25 до 2,5 мкл стоковой суспензии частиц на 1 мл культуральной среды). Клетки инкубировали 3 дня, затем удаляли супернатант и добавляли по 30 мкл/лунку раствора MTT (исходная концентрация 5 мг/мл) (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид) (Sigma, США) для определения пролиферации клеток колориметрическим способом. После завершения инкубации (2-4 ч) добавляли 100 мкл DMSO (ПанЭко, РФ) на лунку. Оптическое поглощение измеряли через 15 мин на приборе Multiscan (Titertek, Швейцария) при длине волны 540 нм. Эксперимент был выполнен в 3-х повторах. Обработку статистических данных производили в программе Microsoft Excel.

Анализ клеточной гибели в PI-тесте. МСК метили магнитными частицами, как описано выше, и культивировали в течение 3 сут. Затем клетки снимали с пластика раствором трипсина/версена (1:1), дважды отмывали раствором Хэнкса и проводили фиксацию и пермеабилизацию ледяным 70 %-ным этанолом не менее 1 ч при 4С. После этого клетки дважды отмывали в PBS (ПанЭко, РФ) центрифугированием (5 мин, 300 g), осадок ресуспендировали в растворе пропидиум иодида (PI) (конечная концентрация 25 мкг/мл), приготовленном на основе PBS и содержащем 10 мкг/мл РНКазы (Sigma, США). Оценку клеточной гибели проводили на проточном цитофлуориметре EPICS Coulter XL. Для каждого образца регистрировали не менее 1х104 событий. Обработку полученных результатов проводили в программе WinMDI. На гистограммах учитывали долю гиподиплоидных клеток, обладающих более низкой флуоресценцией.

Нейрональная дифференцировка МСК in vitro. Клетки рассаживали в 24-луночных планшетах на покровные стекла в концентрации 2,5 тыс/лунку и метили их микрочастицами, как описано выше. В течение суток проводилась предварительная индукция дифференцировки путем замены обычной культуральной среды на среду, содержащую 1 % FBS и 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Контрольные клетки культивировали в той же среде, не содержащей bFGF. Инкубация проводилась при 370С в атмосфере 5% СО2. Через сутки индукционную среду заменяли на дифференцировочную следующего состава: DMEM F-12, 1M RA (ретиноевая кислота), 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF, 100 нг/мл NGF, 10 нг/мл NT-3, 5 мг/мл инсулина, 1 M гидрокортизона, 1 M прогестерона (все - Sigma, США), пенициллин, стрептомицин, L-глютамин. Клетки культивировали в течение 4 недель в СО2инкубаторе со сменой среды 2 раза в неделю. Контрольные клетки культивировали в среде DMEM F-12 с добавлением пенициллина, стрептомицина, L-глютамина, но без факторов дифференцировки.

Анализ экспрессии нейрональных маркеров мезенхимальными стволовыми клетками, выделенными из плаценты человека. Иммуноцитохимическую оценку экспрессии нейрональных маркеров мезенхимальными стволовыми клетками проводили через 4 недели после индукции дифференцировки. МСК дважды промывали раствором PBS, pH 7.4, и фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида (pH 7.4) (Sigma, США) в течение 20 мин при комнатной температуре. После фиксации клетки дважды отмывали PBS и проводили пермеабилизацию 0,6%-ным раствором сапонина (Sigma, США), в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки трижды отмывали PBS. Блокирование неспецифического связывания проводили в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 1% FBS (HyClone, США), 0.1% Tween 20 (Sigma, США). Далее клетки инкубировали с мышиными антителами к человеческим нейрональным маркерам NSE и GFAP (все – 1:100, Chemicon, США) в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего проводили две отмывки, как описано выше. Затем клетки инкубировали с антивидовыми антителами (1:100), мечеными родамином (ex = 550 нм, em = 570 нм) в течение 40-60 мин при комнатной температуре, дважды отмывали их в PBS, содержащем 1% FBS, 0.1% Tween 20. Ядра клеток докрашивали DAPI (1 мкг/мл PBS) (Sigma, США). Визуализацию клеток и получение изображений проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).

Моделирование спинальной травмы. В исследовании были использованы 44 взрослые (2-3 месяца) самки мышей линии С57Bl/6 серии №26 (питомник лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН). Выполняли ламинэктомию 6-8 грудных позвонков (Т6-Т8), обнажая дорсальную поверхность спинного мозга. Для создания стандартизованного ушиба спинного мозга использовали металлический стерильный импактор, цилиндрической формы и окончанием в виде конуса, весом 1 г. Прицельное падение импактора на обнаженную зону спинного мозга проводили однократно с высоты 13 см. Опытным животным (n=21) в область травмы непосредственно после ушиба вводили меченые флуоресцентными микрочастицами МСК плаценты человека (1 млн в 0,1 мл физ. раствора). Контрольной группе (n=23) в область травмы аналогичным образом вводили 0,1 мл физиологического раствора. Протокол экспериментов с животными был рассмотрен и утвержден Этическим комитетом при РГМУ.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.