WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Поведение хромосом в профазе i мейоза у самцов прямокрылообразных насекомых

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КОРНИЕНКО ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

поведение хромосом в профазе I мейоза у самцов прямокрылообразных насекомых

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2010

Работа выполнена на кафедре цитологии и генетики ФГОУ ВПО Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Высоцкая Л.В.,

кафедра цитологии и генетики,

ФГОУ ВПО Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Бородин П.М.,

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

доктор биологических наук,

профессор Беляева Е.С.,

Институт химической биологии и

фундаментальной медицины СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики

им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «__» ________ 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел. (383)-333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «__» __________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение мейоза, открытое у животных еще в 1882 г. Флеммингом, показало, что, несмотря на кажущуюся консервативность, ход мейотических событий может отличаться большим разнообразием. Привлечение разных модельных объектов позволяет составить более полное представление о закономерностях мейотических процессов. Синапсис и рекомбинация – ключевые события профазы I мейоза. Синапсис необходим для встречи и связывания гомологов, что в дальнейшем обеспечивает правильное расхождение хромосом в первом делении мейоза. Рекомбинация и сегрегация хромосом обеспечивают генетическое разнообразие организмов (Жученко, Король, 1985).

У саранчовых, как у мышей, человека и некоторых других видов, для первичного спаривания хромосом необходимы множественные двуцепочечные разрывы ДНК и поиск гомологичных последовательностей в лептотене (Viera et al., 2004). Cинапсис, как правило, начинается с теломерных концов хромосом, но иногда может инициироваться и в интерстициальных областях (Counce, Meyer, 1973; Hasenkampf, 1984). Полностью сформированные синаптонемные комплексы (СК) свидетельствуют об окончании синапсиса. Нарушения в линейной структуре СК у гетерозигот по хромосомным перестройкам, препятствуют распространению интерференции рекомбинационных обменов вдоль бивалентов (Горлов и др., 1991). Неравные оси СК, в случае когда один гомолог длиннее другого, как правило, претерпевают синаптическую подгонку, в противном случае у млекопитающих мейоциты подвергаются пахитенному аресту (Richler, 1986; Коломиец, 1998). У насекомых явление синаптической подгонки практически не изучено.

Выявлены различия в синапсисе и рекомбинации хромосом у гомо- и гетерогаметного полов. Половые хромосомы у гетерогаметного пола обнаруживают особенности поведения в профазе I мейоза: изолированность от аутосом, разнообразные типы синапсиса и видоизмененные формы осевых элементов, существенную укороченность осевых элементов (Solari, Counce, 1977; Бородин, 1992; Агапова, Высоцкая, 1993). Хотя на примере млекопитающих ранее была показана возможность использования характера синапсиса половых хромосом для оценки эволюционных отношений близкородственных видов (Бородин, 1992), у насекомых до сих пор не изучена взаимосвязь особенностей мейотической оси Х-хромосомы с таксономической принадлежностью организмов.

До конца не исследованы причины ограничения рекомбинации в районах С-гетерохроматина. Возможно, что рекомбинационная инертность гетерохроматина обусловлена его меньшей представленностью в составе СК, по сравнению с эухроматиновыми районами (Stack, 1984), что, вероятно, связано с плотной белковой упаковкой хроматина (Westphal, Reuter, 2002; Peng, Karpen, 2007). В настоящее время существует очень мало данных о поведении крупных блоков С-гетерохроматина во время синапсиса и рекомбинации гомологов.

1

Прямокрылообразные насекомые являются удобным объектом для изучения особенностей мейотического поведения хромосом и их отдельных районов. Хромосомы саранчовых и кузнечиков имеют относительно небольшое диплоидное число длинных хромосом, крупные блоки С-гетерохроматина различной локализации. Неплохая общебиологическая изученность этой группы насекомых значительно облегчает и ускоряет проведение исследований сравнительного характера, что позволяет судить об особенностях эволюционных преобразований кариотипов, и что в свою очередь помогает при решении спорных вопросов систематики этой группы. Кариотипы тараканов интересны большим количеством С-гетерохроматина и полиморфизмом по гетерохроматиновым районам, что представляет интерес для изучения явления синаптической подгонки.



Целью исследования явилось выяснение закономерностей поведения хромосом и их отдельных районов во время синапсиса и рекомбинации в профазе I мейоза у прямокрылообразных насекомых.

Задачи исследования:

1. Сравнить характер формирования оси Х-хромосомы и особенности мейотического синапсиса аутосом в первой профазе мейоза у самцов разных видов саранчовых, сопоставив с таксономической принадлежностью видов.

2. Исследовать связь между количеством теломерной ДНК и типом синапсиса хромосом у разных видов саранчовых.

3. Проанализировать поведение Х-хромосомы в сперматогенезе у разных видов прямокрылообразных с ХО-системой определения пола.

4. Исследовать влияние на синапсис и рекомбинацию хромосом крупных блоков С-гетерохроматина разной локализации: дистальных у таракана Nauphoeta cinerea и прицентромерных у саранчового Stauroderus scalaris. Распределение обменов у S. scalaris сравнить с таковым у вида Glyptobothrus biguttulus из той же подтрибы, имеющим небольшой блок прицентромерного гетерохроматина.

5. Исследовать структуру синаптонемных комплексов гетероморфных бивалентов, определить временные и пространственные параметры синаптической подгонки разных хромосом у таракана N. cinerea.

Научная новизна работы.

Впервые проведен сравнительный анализ формирования оси полового унивалента и мейотического синапсиса хромосом у самцов 41 вида саранчовых из трех подсемейств. Электронно-микроскопический анализ срезов семенников у саранчовых, тараканов и кузнечиков показал, что только у саранчовых половой хроматин занимает отдельный ограниченный мембранами компартмент накануне мейоза в премейотической интерфазе. Впервые обнаружено два разных способа влияния протяженных районов С-гетерохроматина разной локализации на синапсис и рекомбинацию хромосом. Показано, что структурные изменения в крупных блоках С-гетерохроматина, происходящие на стадии лептотены, приводят к подавлению спаривания и рекомбинации хромосом за счет образования аномальных осевых элементов у саранчового S. scalaris, посредством формирования хромоцентра у таракана

2

N. сinerea. Впервые описана синаптическая подгонка у таракана N. cinerea в случае гетерозиготности по блокам гетерохроматина. Показано, что короткие биваленты подвергаются синаптической подгонке раньше длинных хромосом и всегда формируют синаптонемные комплексы с утолщением на конце, синаптонемные комплексы длинных бивалентов в половине случаев выявляются с неспаренным концом. Продемонстрировано, что отсутствие синаптической подгонки синаптонемных комплексов в гетероморфных бивалентах в сперматоцитах таракана N. cinerea не приводит к пахитенному аресту.

Практическая значимость работы.

Данное исследование расширило представления о способах и ограничениях мейотического синапсиса гомологичных хромосом. Полученные данные о том, что прерывание синаптонемного комплекса в центромерном районе двуплечей хромосомы повышает уровень рекомбинации в обоих плечах, имеют фундаментальное значение для выяснения механизмов регуляции кроссинговера. Результаты сравнительно-морфологического анализа оси Х-хромосомы и мейотического синапсиса самцов саранчовых семейства Acrididae подтверждают представления ряда ортоптерологов о независимом статусе подсемейства Locustinae, что имеет практическое значение для уточнения систематики саранчовых.

Апробация работы и публикации.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 3 статьи — в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ. Материалы диссертации были представлены на студенческих конференциях, Международной конференции по ортоптероидным насекомым (Montpellier, 2001), Международном симпозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, 2003), 12-ом и 13-ом съездах Русского Энтомологического Общества (Санкт-Петербург, 2002; Краснодар, 2007), Сибирской зоологической конференции (Новосибирск, 2004), 4-ой Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных (Санкт-Петербург, 2006), Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009).

Вклад автора.

Автором самостоятельно была выполнена основная часть работы. Ультратонкие срезы были сделаны к.б.н. С.И. Байбородиным, частично использованные негативы и препараты были предоставлены к.б.н. О.А. Агаповой, Д.Ч. Степановой, к.б.н. А.М. Гусаченко и д.б.н., проф. Л.В. Высоцкой. ДНК-пробы для проведения FISH были приготовлены к.б.н. В.А. Трифоновым и А.И. Кулемзиной. Определение видовой принадлежности всех насекомых было сделано д.б.н., проф. М.Г. Сергеевым.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 227 ссылок, приложения, списка публикаций по теме диссертации. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, включая Приложение, содержит 31 рисунок и 6 таблиц.

3

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Личинки последнего возраста и взрослые самцы саранчовых и кузнечиков были отловлены в летнее время на территории Новосибирской области, Алтая, Хакасии и Тувы в период с 1997-2007г.г. Лабораторные культуры тараканов Nauphoeta cinerea и Blaberus sp. (подсемейство Blaberidae) были привезены из ХГУ и ТГУ.





Ниже приведен список из 41 вида изученных саранчовых семейства Acrididae, 34 из которых взяты для анализа мейоза в данной работе, а материал по 7 видам (отмечены звездочками) привлечен из литературы. Изученные саранчовые принадлежат трем подсемействам семейства Acrididae:

Подсемейство Acridinae: триба Dociostaurini - Dociostaurus brevicollis (Ev.); триба Gomphocerini - Aeropedellus variegatus (F.d.W.), Schmidtiacris schmidti (Ikonn.), Chorthippus hammarstroemi (Mir.), Ch. albomarginatus (DeG.), Ch. dichrous (Ev.), Ch. vagans* (Ev.), Glyptobothrus biguttulus (L.), G. brunneus* (Thnb.), G. jacobsi* (Harz.), Omocestus burri* (Uv.), Om. viridulus (L.), Gomphocerus rufus (L.), Megaulacobotrus aethalinus (Zub.), Aeropus sibirucus (L.), Stauroderus scalaris (F.d.W), Stenobothrus lineatus (Panz.), Euchorthippus pulvinatus (F.d.W); триба Chrysochraontini - Chrysochraon dispar (Germ.), Euthystira brachyptera (Ocsk.), Podismopsis poppiusi (Mir.); триба Arcypterini - Arcyptera fusca (Pall.); триба Parapleurini - Stetophyma grossum* (L.). Подсемейство Catantopinae: триба Melanoplini - Melanoplus differencialis* (Thom.), Ognevia longipennis (Shir.), Podisma pedestris (L.); триба Caloptenini - Calliptamus italicus (L.); триба Cyrtacanthacridini - Anacridium aegiptium (L.), Schistocerca gregaria* (Forsk.).

Подсемейство Locustinae: триба Locustini - Locusta migratoria (L.), Oedaleus decorus (Germ.), Pyrgodera armata (F.d.W.); триба Sphingonotini - Sphingonotus sp.; триба Oedipodini - Oedipoda caerulescens (L.), Oe. miniata (Pall.), Celes variabilis (Pall.), C. scalozubovi (Adel.); триба Bryodemini - Angaracris barabensis (Pall.), Bryodema tuberculatum (F.), B. gebleri (F.d.W); триба Epacromiini - Epacromius pulverulentus (F.d.W)

Фиксация материала и приготовление препаратов для анализа на свето-микроскопическом уровне: Семенники инкубировали в растворе 0,9% цитрата натрия с 0,01-0,04% колхицином 0,5-2 часа, фиксировали в смеси 96% этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, отмывали в 70% этаноле. Фиксированный материал хранили в 70% этаноле в холодильнике при +4°С. Для анализа кариотипов насекомых готовили давленые препараты: фиксированный материал мацерировали в капле 60% уксусной кислоты на предметном стекле, раздавливали под покровным стеклом, замораживали в жидком азоте. Препараты сушили и окрашивали С-дифференциально по методу Джонса (Jones et al., 1975) с некоторыми модификациями. Препараты анализировали при помощи светового микроскопа Jenaval (Zeiss, Германия).

Фиксация материала и приготовление срезов для электронно-микроскопического анализа: Семенники фиксировали в растворах глутарового альдегида (2,5%) и тетраоксида осмия (1%). Далее

4

дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и в ацетоне, одиночные фолликулы заключали в смолу. Ультратонкие срезы (60-70 нм) получали на ультратоме “Ultracut” (Reichert – Jung, Австрия), наносили на электронно-микроскопические сеточки, контрастировали цитратом свинца. Анализ проводили на электронном микроскопе Jem-100SX (Jeol, Япония).

Приготовление распластанных препаратов для анализа синаптонемных комплексов: Препараты для электронно-микроскопического анализа синаптонемных комплексов готовили по методу Дрессера и Мозеса (Dresser, Moses, 1980). Стекла покрывали пленкой из пластика (0,3%-ный раствор в хлороформе). Семенники инкубировали в 0,9% цитрате натрия, надрывали кончики фолликулов, суспендировали клеточную массу. Раскапывали по 25-50 мкл клеточной суспензии на поверхность капли 0,3 М сахарозы, высушивали, затем фиксировали в 4% растворе формальдегида (рН 8,2) для стабилизации белков синаптонемного комплекса и промывали. Препараты окрашивали 50% AgNO3 ускоренным способом (Howell, Black, 1980), отмывали водой, высушивали. Вырезанные участки пленки с клетками переносили на электронно-микроскопические сеточки. Анализ проводили на электронном микроскопе Jem-100SX (Jeol, Япония).

Подготовка и проведение FISH: Суспензионные препараты метафазных хромосом обрабатывали трипсином (0,12 %), для FISH c рибосомной ДНК-пробой человека — с панкреатической РНКазой А, фиксировали 1% формальдегидом. Проба к (TTAGG)n теломерному повтору была приготовлена с помощью ПЦР, где в качестве матрицы использовали праймеры (GGTTA)4GG и (TAACC)4TAA. Полученные теломерные последовательности метили биотином. Гибридизацию ДНК-проб с хромосомами насекомых и детекцию биотинилированных зондов осуществляли способами, описанными ранее в работах, используя некоторые модификации (Grafodatsky et al., 2000; Yang et al., 2000). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Imager. A1 (Carl Zeiss). Сигнал регистрировали с помощью CCD-камеры и программного обеспечения “ISIS4” фирмы METASYSTEMS GmbH (Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительно-морфологический анализ формирования оси Х-хромосомы и мейотического синапсиса аутосом у самцов разных видов саранчовых. В настоящее время большое разнообразие саранчовых, межконтинентальные различия в видовом составе затрудняют создание единой и безупречной таксономической системы. Кроме того, отдельные исследователи расходятся в оценке вклада разных анатомо-морфологических признаков в классификацию этих насекомых. На сегодняшний день спорными и трудно решаемыми вопросами систематики являются критерии выделения крупных таксонов. В данной работе предпринята попытка использовать



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.