WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

Роль альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов сосудов в патогенезе поражения легких мышей линии с57bl/6 после инфицирования вирусом гриппа а/h5n1 a/goose/krasnoozerskoye/627/05

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КОВНЕР

АННА ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ АЛЬВЕОЛОЦИТОВ, МАКРОФАГОВ И ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ СОСУДОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ПОРАЖЕНИЯ ЛЕГКИХ МЫШЕЙ ЛИНИИ С57Bl/6 ПОСЛЕ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ ГРИППА А/H5N1 A/GOOSE/KRASNOOZERSKOYE/627/05

14.03.03 – патологическая физиология

03.03.04 – клеточная биология, гистология, цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научный центр клинической и экспериментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шкурупий Вячеслав Алексеевич

кандидат медицинских наук Потапова Оксана Валентиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

«кафедры физиологии»,

факультет естественных наук,

ФГБОУ ВПО НГУ Шестопалова Лидия Владимировна

доктор биологических наук,

гл. н. с., руководитель

лаборатории цитологии и

клеточных структур,

ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН Архипов Сергей Алексеевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Защита состоится «23» октября 2012 г. в «10-00» часов на заседании диссертационного совета Д.001.048.01. при ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2; г. Новосибирск, 630117; тел./факс (383) 333-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке "НЦКЭМ" СО РАМН

Автореферат разослан «___» ________ 2012 г

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Пальчикова Н.А.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время инфекции, передающиеся воздушно-капельным путем занимают лидирующие позиции среди всех инфекционных заболеваний человека. Вирус гриппа (ВГ) А/H5N1 наиболее патогенный среди других вирусов гриппа. По данным ВОЗ уже за 2010-2011 гг, в эпизоотию, вызванную ВГ А/H5N1, были вовлечены страны Африки, Азии и Европы и летальность среди людей остается по-прежнему высокой – от 60 до 73%; среди детей – до 15 лет – до 89% ( http://www.who.int/ru/ , 2010-2011).

Постоянная «эволюция» вирусов гриппа А/H5N1, возможность их реассортации с адаптировавшимися в человеческой популяции штаммами вируса гриппа А и лекарственная полирезистентность к имеющимся противовирусным препаратам являются факторами, обусловливающими опасность появления нового высокопатогенного и высококонтагиозного антропозоонозного вируса гриппа А/H5N1 и его распространения как пандемичного (ВОЗ, 2010; Shortridge K.F. et al., 2000; Ilyushina N.A. et al., 2010). Несмотря на высокую актуальность проблемы гриппа ряд аспектов патогенеза данного заболевания у млекопитающих и человека остается малоизученным.

Наиболее выраженные патологические изменения при вирусе гриппа А/H5N1 проявляются в дыхательных путях млекопитающих и человека, что связано с пневмотропностью вируса (Свирщевская Е.В. и др., 2005; van Riel D. et al., 2006). Поэтому ведущее значение в иммунопатогенезе гриппа А/H5N1 принадлежит альвеолоцитам, эндотелиоцитам сосудов легких и клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) – легочным макрофагам, как первой линии защиты, которые имеют свои функциональные особенности. Благодаря своей фагоцитозной и секреторной активности, макрофаги выполняют функцию барьера на пути проникновения в организм возбудителя, способствуя ограничению распространения вируса в организме, и играют ключевую роль в инициации и регуляции иммунного ответа при гриппе. Количественная и функциональная недостаточность исследуемых клеток является основой возникновения ряда тяжелых осложнений при инфекционных заболеваниях, в том числе и при вирусных инфекциях (Шкурупий В.А. и др., 1999; Li N. et al., 2008).

Комплексная иммуноморфологическая оценка структурно-функциональных особенностей исследуемых клеток при гриппе А/H5N1 позволит не только улучшить диагностику вирусных инфекций, научно обоснованно осуществить прогнозирование развития болезни и её осложнений, но и одновременно осуществить принципиально новые подходы к профилактике и лечению гриппа, направленные на снижение риска заболеваемости гриппом людей и уменьшение частоты и тяжести его осложнений.

Цель исследования: изучить морфофункциональные и количественные изменения клеток легких (альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов и макрофагов) мышей линии С57Bl/6 в процессе формирования противовирусного ответа на инфицирование вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Задачи исследования:

1. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких у интактных мышей линии С57Bl/6.

2. Методами иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии исследовать топологию вируса в клетках легких мышей линии С57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 на разных сроках заболевания.



3. Изучить структурно-функциональные изменения легких мышей линии С57Bl/6 в динамике развития вирусной инфекции.

4. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких мышей линии С57Bl/6 после инфицировании вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 и их вероятную регуляторную роль в развитии вирусной инфекции.

Научная новизна. Впервые на интактных мышах-самцах линии С57В1/6 методами морфометрии и иммуногистохимии было показано, что альвеолоциты, эндотелиоциты и макрофаги легких вне зависимости от специализированных функций клеток первых двух типов представляют собою единую структурно-функциональную систему поэлементно способную дополнять друг друга в выполнении функции поддержания гомеостаза в организме своими развитыми системами лизосомальных протеаз, NO-синтаз, экспрессией полипотентных провоспалительных цитокинов TNF- и IL-6.

Впервые методами иммунофлуоресцентной микроскопии было показано персистирование вируса гриппа А/H5N1 штамма A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов легких и макрофагах мышей линии C57Bl/6. Было установлено, что первыми в противовирусную «борьбу» включаются и инфицируются альвеолоциты в связи с анатомическим расположением и наличием у них на клеточной поверхности сиаловых кислот, затем эндотелиальные клетки сосудов, что свидетельствует о диссеминации вируса и легочные макрофаги.

Вирус индуцирует в этих клетках процессы деструкции апоптозом, их пролиферацию, активацию экспрессии внутриклеточных энзимов (лизосомальные гидролазы – lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase, NO-синтазы – eNOS и iNOS), а также цитокинов. Показано, что кроме цитопатического действия вирусов на эти клетки после интернирования в них, на увеличение масштаба деструктивных процессов в легких оказывают влияние развивающаяся патогенетически поэтапно – системная гипоксия и ишемия вследствие: деструкции сосудов с развитием геморрагических и тромбоэмболических осложнений, повышения проницаемости и развития отечного синдрома в интерстиции и альвеолах, деструкции альвеолярного эпителия и острой диффузной эмфиземы, активации синтеза оксида азота и создания условий для лабилизации мембран лизосом с последующей стимуляцией репаративной регенерации по типу substitucio, усугубляющей нарушение процессов газообмена. Впервые показано, что инфицирование этих клеток кроме деструкции сопряжено с выраженной активацией процессов пролиферации, восстанавливающей нарушенный структурный гомеостаз в легких, но расширяющих трофическую базу для вируса. Показано, что инфицирование вирусом гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с существенной активацией клеточного звена иммунитета, резкого увеличения экспрессии провоспалительных полипотентных цитокинов TNF- и IL-6, способных также усилить как процессы пролиферации и деструкции так и фиброзирования органа. Изучены масштабы и динамика экспрессии каждого из этих цитокинов клетками трех вышеупомянутых типов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные дополняют известные сведения о патогенезе гриппа А H5N1 в легких млекопитающих (Шаркова Т.В. и др., 2008; Шестопалов A.M. и др., 2008; Uiprasertkul M.P. et al., 2007; Zeng H. Et al., 2012).

Масштабы, характер и динамика исследованных деструктивных последствий в легких после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 свидетельствуют о необходимости максимально ранних профилактики и лечения данного заболевания. Полученные результаты о роли альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов сосудов легких в патогенезе деструкции легких после инфицирования вирусом гриппа А могут быть использованы для разработки средств профилактики заболевания и лечения осложнений.

Полученные данные существенно дополняют плохо изученный патогенез вирусной инфекции, вызываемой новым штаммом вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, что может быть внедрено в процесс преподавания, патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетической профилактики и терапии в соответствии с формирующимися синдромами заболевания.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы

«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.», госконтракт № 02.740.11.0709.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. ВГ АН5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 способен инфицировать альвеолоциты, эндотелиоциты сосудов и макрофаги легких, что сопряжено с их гибелью и персистенцией вируса в них на протяжении всего эксперимента. Инфицирование этим вирусом гриппа индуцирует развитие каскада патологических процессов, итогом, которых является создание условий для развития острой системной гипоксии и ишемии, следствием которых являются масштабные процессы деструкции, доминирующие в проявлениях ответной реакции организма (в частности легких) на вирус.

2. Инфицирование мышей ВГ А/H5N1 сопряжено с активацией репаративных процессов, проявляющихся пролиферацией альвеолоцитов, эдотелиоцитов сосудов и макрофагов легких, способствующих восстановлению утраченных структур, но расширяющих трофическую базу для вируса. Они проявляются заместительным, и постгипоксическим фиброзированием легких, ухудшающим условия для газообмена в интерстиции.





3. Альвеолоциты и эндотелиоциты вне связи с их специализированными функциями вместе с макрофагами легких формируют единую систему сохранения внутренней среды организма за счет высокой экспрессии ими протеаз и NO-синтаз, способности резко усиливать экспрессию TNF- и IL-6. Вместе с тем, в условиях острой гипоксии, эти проявления защитной функии вышеуказанных клеток могут усугубить деструкцию легких в связи с возможной пермеабилизацией лизосом, усилением образования активированных метаболитов кислорода. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5N1 сопряжено с активацией клеточного звена иммунитета, однако недостаточной для его эффективной элиминации.

Внедрение результатов работы в практику. Основные положения работы внедрены в практику преподавания на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрав России в раздел «Иммунопатологические процессы и «Инфекционные болезни».

Апробация работы. Материалы исследований доложены на XLIX Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2011); IV Международной научно-практической конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы, список цитированной литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 321 источник, в том числе 267 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве инфекционного агента был выбран вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выделенный из легкого гуся, погибшего во время вспышки гриппа птиц в селе Кразноозерское Новосибирской области в сентябре 2005 года. Экспериментальные работы с вирусами гриппа А/H5N1 были проведены на базе лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа, ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" (Новосибирск) в соответствии с санитарными правилами безопасности работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами (СП 1.2.731 от 25.01.05).

Работа выполнена на 90 мышах-самцах линии С57Bl/6, в возрасте 2 месяцев с массой тела 20-25 г (питомник лабораторных животных НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище. Перед проведением эксперимента их адаптировали к условиям содержания. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации.

Для проведения эксперимента было сформировано 3 подопытных группы животных:

Первая группа – контрольная – была представлена интактными животными (20 мышей).

Вторая группа состояла из 50 мышей, которых инфицировали вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, для изучения патогенеза инфекции данного процесса.

Третья группа состояла из 20 мышей, которых инфицировали ВГ А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, у которых изучали патогенность штамма по показателю летальности животных, выраженного в процентах.

Для морфологического исследования животных первой и второй групп выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе. Сбор материала проводили на 1, 3, 6, 10 и 14 сутки после инфицирования. Объектом исследования служили легкие.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН «Современные оптические системы».

Для светооптического исследования, полученный материал, после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и ксилолов и заключали в синтетическую парафиновую смесь «HISTOMIX» (BioVitrum). Срезы изготавливали на микротоме ("MICROM", Германия) толщиной 3,5 мкм. Окраску проводили по стандартной методике гематоксилином и эозином (обзорная), пикрофуксином по методу ван Гизон (выявление волокон соединительной ткани).

Проводили ИГХ-анализ с использованием непрямого AEC (стрептавидин-пероксидазного) метода для оценки: пролиферативной (PCNA ("Novocastra")), функциональной и профибротической активности легочных макрофагов, альвеолоцитов и эндотелиоцитов (Cathepsin D ("DBS"), Myeloperoxidase ("DBS"), Lysozyme ("DBS"), iNOS ("Spring BioScience"), eNOS ("Abcam"), TNF- ("DBS"), IL-6 ("Novocastra")); степени выраженности неоангиогенеза (CD-31 ("BioCare Medicine"), CD-34 ("Spring BioScience")); фенотипирования клеточного состава интерстициальных инфильтратов (CD-1 ("Spring BioScience"), CD-4 ("Spring BioScience"), CD-8 ("Abcam"), CD-68 ("DBS"), Fibroblast ("DBS")); механизмов клеточной смерти (Сaspase-3 ("Abcam")).

Для проведения ИГХ-исследования срезы легких толщиной в 3 мкм подвергали депарафинизации, регидратации, демаскировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W, в течение 20-25 минут. Затем, после однократного промывания в дистиллированной воде и фосфатном буфере (PBS), производили блокирование эндогенной пероксидазы в течение 5 минут. Время экспозиции с первичными антителами составляло 30–45 минут при температуре 37°С. Затем срезы инкубировали со стрептавидин-пероксидазным комплексом, DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера. Затем проводили по спиртам возрастающей концентрации и ксилолам, покрывали синтетической покровной средой «Bio Mount» (Bio Vitrum) и заключали под покровное стекло.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.