WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Синцитиальная цитоплазматическая связь и слияние нейронов некоторых беспозвоночных

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЛАКТИОНОВА АЛЕКСАНДРА АЛЕКСАНДРОВНА

СИНЦИТИАЛЬНАЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ СВЯЗЬ И СЛИЯНИЕ НЕЙРОНОВ НЕКОТОРЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

03.03.01 физиология

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2011

Работа выполнена в лаборатории функциональной морфологии

и физиологии нейрона Института физиологии им. И. П. Павлова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Сотников Олег Семенович
Официальные оппоненты: Отеллин Владимир Александрович, д.м.н., чл.-корр. РАМН, профессор, Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Чепур Сергей Викторович, д.м.н., профессор, начальник ФГУ «ГосНИИИ военной медицины МО РФ» НИИЦ (медико-биологической защиты)
Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится «26» декабря 2011 года в _11_ часов

на заседании Диссертационного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, г. Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Автореферат разослан «___» __________ 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук Н.Э. Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время нет сомнений в том, что основными формами межнейрональной коммуникации являются синаптическая и электрическая связь с помощью щелевых и плотных мембранных контактов. В тоже время в литературе появляется все больше данных о том, что в отдельных частях нервной системы или в определенных условиях иногда может встречаться цитоплазматическая синцитиальная связь. Некоторые электрофизиологи стали обозначать термином «синцитиум» электрическую связь между нейронами через gap junction (Foster, Sangelaub, 2004). При этом нередко даже не упоминается, что речь идет об электрическом синцитии (Rash, 2000; Maftahof, 2005), как будто бы цитоплазматического синцития вообще не существует. Тем не менее, цитоплазматическая связь и слияние клеток на базе синцития возможны у клеток всех тканевых типов (El-Darsh, Whitfield, 2000; Hartenstein, Jones, 2003; Okazaki, 2007). Так, в экспериментах путем образования синцития, с последующим слиянием клеток, формируются различные гомо- и гетерогенные гибридные клетки (Рингерц, Сэвидж, 1979; Ferrer, Namiq, Carda, 2002).

В 2003 году убедительно показана возможность слияния in vitro и in vivo нервных клеток и мезенхимных стволовых клеток костного мозга (Alvarez-Dolado et al., 2003; Weimann et al., 2003; Bae et al., 2005). Недавно продемонстрировано также слияние клеток, экспрессирующих проинсулин с нейронами спинальных ганглиев (Terashima et al., 2005). Показано слияние клеток микроглии с апикальными дендритами пирамидных нейронов неокортекса под влиянием ретровирусов (Ackman et al., 2006). Отмечена важная роль слияния нейронов с ненервными клетками в развитии нейропатологии (Crain, Tran, Mazey, 2005; Bae et al., 2007). Все эти данные свидетельствуют о такой же способности нейролеммы к слиянию и образованию синцития, какая существует и у других ненервных клеток. Возникает вопрос, почему же только нейроны не способны создавать синцитий и сливаться. И так ли это?

Есть основания считать, что нейроны обладают способностью создавать синцитиальные связи, об этом свидетельствуют многочисленные находки синцитиев у беспозвоночных (Young, 1938; Nicol, 1948; Carr, Taghert, 1988). В нашей лаборатории морфологическими методами продемонстрирована реальность существования синцитиальной цитоплазматической межнейронной связи в периферической вегетативной нервной системе, гиппокампе, коре большого мозга (Сотников и др., 2009; Сотников и др., 2010; Сотников и др., 2011). Недавнее электрофизиологическое исследование (McCarthy, Tank, Ehquist, 2009) доказало формирование синцитиальных связей на базе щелевых контактов, завершающееся слиянием нейронов. Однако наличие синцитиальной цитоплазматической связи нейрон-нейрон нуждается в дополнительных исследованиях.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование межнейрональной цитоплазматической синцитиальной связи в нервной системе некоторых беспозвоночных.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

  1. Выявить межклеточные синцитиальные связи в нервной системе беспозвоночного in situ.
  2. Исследовать причину появления спонтанного слияния нейронов в культуре ткани.
  3. Разработать способ цитоплазматического синцитиального слияния нейронов в эксперименте.
  4. Осуществить энуклеацию нейронов, получив безъядерные цитопласты и кариопласты, и изучить возможность их слияния с другими нейроцитами.

Научная новизна исследования. Проведенные исследования впервые выявили глионейритные цитоплазматические связи в периферической нервной системе речного рака, тем самым были показаны значительные адгезионные возможности нейроллемы и ее способность к слиянию с мембранами других клеток.



Экспериментально доказана невозможность использования некоторых общепринятых методик слияния ненервных клеток в опытах с изолированными нейронами моллюска.

Впервые разработана методика экспериментального получения цитоплазматических синцитиальных связей живых нейронов и их слияния.

Доказано, что нейроны подобно клеткам других тканевых типов способны к энуклеации, образованию безъядерных цитопластов и кариопластов, и их слиянию с другими нейронами.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическим значением работы является представление дополнительных экспериментальных данных, свидетельствующих о существовании в нервной системе не двух, а трех типов межнейронных связей: синаптической, контактной электрической и синцитиальной цитоплазматической.

Практическое значение состоит, во-первых, в том, что в диссертации разработана, апробирована и запатентована методика экспериментального получения синцитиальной связи и слияния нейронов. Во-вторых, полученные новые данные могут быть использованы для реконструирования нейронов и экспериментального моделирования с фрагментами нейрона, то есть энуклеации, образованию безъядерных цитопластов и кариопластов, и их слиянию. Это открывает практическую возможность для разработки методики слияния ампутированных нервных отростков (цитопластов) с телами нейроцитов. Полученные данные также представляют собой принципиально новое дополнение к курсу нейрофизиологии нейрона.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Возможность образования синцитиальных цитоплазматических связей в периферической нервной системе речного рака.
  2. Посредством выделения одиночных, лишенных глии нейронов, основанном на энзиматической обработке ганглиев моллюсков, стабильно воспроизводится слияние нервных клеток, что позволяет разработать «Способ моделирования синцитиальных связей между нервными клетками in vitro», перспективный для использования в практике экспериментальных исследований, и получить дву- и многоядерные нервные клетки.
  3. Осуществление энуклеации нейронов, с получением безъядерных цитопластов и кариопластов, и их слияние демонстрирует теоретическую возможность слияния безъядерных фрагментов нейрона с другой нервной клеткой.

Апробация материалов диссертации. Результаты работы были представлены на Научно-практической конференции молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург – Колтуши, 2007); XII Научной конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2008); VI Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008); IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology «Simple nervous system» (St.-Petersburg, 2009); VII Всероссийской конференция, посвященной 160-летию со дня рождения И. П. Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2009); VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009); Международном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2010); на X Конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); XXI Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга, 2010); Всероссийской конференции «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды» (Санкт-Петербург, 2010); Конференции молодых ученых «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург, 2010); III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 научная работа, из них 5 статей в журналах из списка ВАК, 1 запатентованное изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, шести глав с изложением экспериментальных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 161 страницу. Из них – 51 рисунок и 2 таблицы. Список литературы включает 313 источников: 107 отечественных и 206 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на нейронах пресноводных моллюсков Lymnaea stagnalis и Planorbis corneus vulgaris, а также на периферических нервных стволах речного рака Astacus leptodactylus.

Методика культивирования изолированных нейронов моллюска. Окологлоточное нервное кольцо моллюсков после отсечения нервов переносили в физиологический раствор, с добавлением 50 мкг/мл гентамицина сульфата, при комнатной температуре. После этого нервное кольцо разрезали на ганглии, которые переносили в 0.4 % раствор проназы (Serva), приготовленный на физиологическом растворе для моллюсков, при температуре 20-22 С на 50 мин.





После ферментативной обработки выделенных ганглиев, тонкими препаровальными иглами снимали соединительнотканную капсулу и проводили пипетирование, вначале с помощью Г-образной стеклянной микропипетки с диаметром отверстия кончика 0.8 мм, а затем микропипеткой с диаметром 0.6 мм. В результате удавалось получить значительное количество изолированных, лишенных глии нейронов. Для культивирования использовали бессывороточную питательную среду с определенным химическим составом RРМI-1640 (БиолоТ) или Игла МЕМ (Sigma) без глютамина и бикарбоната, которые стерилизовали непосредственно перед посадкой. В среду также добавляли гентамицина сульфат в концентрации 50 мкг/мл, L-глютамин в концентрации 0.3 г/л. С помощью бикарбоната натрия устанавливали pH среды 7.8 рH-метр типа рH-150 (Hanna, Romania). Для исследования одиночных нейронов применяли микрокамеры, которые представляют собой стеклянные кольца высотой 0.8 см и диаметром 0.8 см (подробнее методику см. Костенко и др., 1998). Посадку нейронов проводили в специальном вентилируемом стерильном помещении.

Культуру исследовали в течение 1-6 дней. Наблюдение за нейронами с первых минут после посадки осуществляли на компьютерной автоматизированной микровидеоустановке, созданной на базе инвертированного фазовоконтрастного микроскопа МБИ-13 (ЛОМО). Производили цейтраферную видеосъемка – 1 кадр каждые 15мин. Полученные в формате BMP изображения переводили в формат Jpeg и подвергали морфологическому анализу.

Методика электронно-микроскопических исследований. Изолированные нейроны моллюсков, после их агрегации центрифугированием, и периферические нервные стволы речного рака фиксировали в течение 1 часа охлажденным 2.5 %-м раствором глютарового альдегида (рН=7.4), разведенным 0.1 М какодилатом натрия. В последующем проводили дофиксацию 1 %-м охлажденным раствором четырехокиси осмия (OsO4) в течение 30мин. Далее осуществляли дегидратацию и заливку материала общепринятым методом для электронно-микроскопических исследований. Фиксированный материал резали на ультратоме LKB-5 (Швеция) на полутонкие срезы и просматривали их под фазовоконтрастным микроскопом. Ультратонкие срезы изучали под электронным микроскопом LEO 10 (Германия) при напряжении 8000 В. Срезы контрастировали цитратом свинца в течение 30мин. Негативы сканировали в просвечивающем режиме с помощью сканера UMAX Astra 4000V (Тайвань). Позитивные изображения подвергали морфологическому анализу.

Методика слияния нейронов с помощью вспомогательных агентов.

Слияние нейронов с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). 0.5 г ПЭГ с молекулярной массой 2000 расплавляли в термостате. К расплавленному раствору ПЭГ при температуре 32-34 С добавляли 0.5 мл культуральной среды Игла МЕМ (Sigma). Полученный 50 %-ный раствор доводили с помощью 1N раствора NaOH до рН=7.6. Изолированные одиночные нейроны, находящиеся на часовом стекле, помещали в теплую культуральную среду (32-34 С), по каплям осторожно прибавляли 1 мл 50 %-ного раствора ПЭГ (температура 34 С). Через 1 мин после добавления ПЭГ, тщательно промывали клетки теплой культуральной средой 3-4 раза и исследовали под инвертированным фазовоконтрастным микроскопом.

Слияние нейронов под воздействием полистирольных латексных шариков. В экспериментах использовали монодисперсный латекс полистирола с карбоксилированной поверхностью латексных частиц с диаметром 220 нм. Латекс вводили как в нормальную культуральную среду, содержащую одиночные изолированные живые нейроны, так и в среду, приготовленную на физиологическом растворе для моллюсков без Са2+ и Mg2+, в концентрации 0.1 мг/мл. Далее проводили центрифугирование в течение 30 мин 800 об/мин и помещали нейроны в микрокамеры для исследования с помощью фазовоконтрастной микроскопии.

Методика экспериментального слияния тел нейронов. Изолированные, лишенные глии и соединительной ткани, нервные клетки моллюсков переносили в стерильную центрифужную пробирку со средой. Перемещение клеток и центрифугирование проводили в специальном стерильном боксе. Нейроны центрифугировали в течение 15 мин при 3000 оборотов в минуту. Нервные клетки оставляли в центрифужной пробирке с культуральной средой на 2 суток. Центрифугирование применяли для агрегации клеток. Далее нейроны фиксировали для электронно-микроскопических исследований.

Методика исследования энуклеации нейронов под воздействием цитохалазина В. Изолированные нейроны помещали в стерильную среду Игла МЕМ (Sigma). Для энуклеации использовали цитохалазин В (Sigma, США), который растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (1 мг/мл) и затем разводили в культуральной среде до концентрации 10 мкг/мл. Культивирование проводили в течение 8-24 часов.

Методика энуклеации нервных клеток приводит к формированию кариопластов – ядер, окруженных узким слоем цитоплазмы и мембраной, и цитопластов – оставшейся цитоплазмы, окруженной мембраной. Жизнеспособность цитопластов проверялась по гранулообразованию при окрашивании объектов метиленовым синим. Для более полного отделения большинства ядер от цитоплазмы клетки проводили дополнительное механическое воздействие путем пипетирования. Микроскопию осуществляли с помощью инвертированного фазовоконтрастного микроскопа МБИ-13 (ЛОМО).

В контроле проверяли, не вызывает ли энуклеацию ядра растворитель цитохалазина B ДМСО. Для этого, в таких же опытах, к 100 мл культуральной среды добавляли 1 мл ДМСО без цитохалазина.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.