WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 || 3 |

Синцитиальная цитоплазматическая связь и слияние нейронов некоторых беспозвоночных

-- [ Страница 2 ] --

Методика слияния цито- и кариопластов с телами нервных клеток. Нервные клетки помещали в стерильную питательную среду Игла МЕМ (Sigma), содержащую 10 мкг/мл цитохалазина В. Этой средой заполняли стерильную центрифужную пробирку и осторожно Г-образной пипеткой переносили в нее выделенные нейроны. Выдерживали клетки в среде с цитохалазином В в течение 4 (1-я серия опытов) или 18 (2-я серия опытов) часов, после чего проводили пипетирование энуклеированных клеток в течение 5-10 мин для окончательного отделения кариопласта от цитопласта. Полученные кариопласты и цитопласты, промывали чистой культуральной средой. Затем к этим фрагментам добавляли только что выделенные нервные клетки с целью добиться слияния цитопластов с телами живых нейронов. Для сближения целых нейронов и фрагментов нейронов осуществляли центрифугирование в течение 5 мин при 400 оборотах в минуту и сохраняли в таком виде в культуральной среде в течение двух суток. Таким образом, в первой серии фрагменты нейронов находились в питательной среде 28 часов, а во второй серии в течение 56 часов. Агрегаты слившихся тел живых нейронов и фрагментов нервных клеток фиксировали для электронно-микроскопических исследований.

Анализ полученных данных осуществлялся с помощью многократного просмотра накопленного материала, а также на основе сравнительного изучения фотографий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При электронно-микроскопических исследованиях периферических нервных стволов речного рака удалось выявить сложные глионейритные отношения в его нервной системе. Впервые обнаружены продленные и точечные глионейритные плотные контакты, которые, располагаясь серийно, сужают межклеточную щель, образуя ее варикозные деформации. Разрыв мембран в области контакта приводит к формированию глионейритной поры (менее 8 нм), которая, расширяясь, образует крупные (до 240 нм) синцитиальные перфорации (рис.1). На кромке перфорации либо встречаются остатки плотных контактов в виде тонких палочкообразных структур, либо поврежденные мембраны, сливаясь, закругляются. В просвете перфорации всегда имеются остаточные мембранные тельца в виде нескольких везикул. Их отклонение от срединной линии может свидетельствовать о взаимной транслокации веществ глио- и нейроплазмы.

Рис. 1. Варианты строения глионейритных синцитиальных цитоплазматических перфораций.

а – варикозности межклеточной глионейритной щели предшествуют образованию синцитиальной перфорации; б, в – увеличенные фрагменты рис. 1а. 1 – везикулярные остаточные тельца в просвете перфораций; 2 – плотный глионейритный контакт у кромки перфорации; 3 – интимная глиальная оболочка нейрита; 4 – варикозная деформация глионейритной межклеточной щели; стрелки – синцитиальные цитоплазматические глионейритные перфорации. Электронная микроскопия. Масштаб 1мкм.

Таким образом, удалось обнаружить образование синцитиальных связей нейритов с клетками других типов, как это было показано ранее (El-Darsh, Whitfield, 2000; Bae et al., 2007; Okazaki, 2007). Наш материал свидетельствует о высоких адгезионных свойствах мембраны нейронов и их способности формировать мембранные контакты и синцитиальные перфорации, причем прослеживается непосредственная связь мембранных контактов и синцитиальных анастомозов, что говорит о едином процессе превращения мембранных контактов в цитоплазматические синцитиальные связи.

На возможность слияния живых нейронов в культуре ткани указывают находки отдельных синцитиально слившихся нервных клеток непосредственно после препаровки клеток и их обработки проназой. Эти нейроны, не только не подвергаются диссоциации проназой, но и имеют абсолютный признак слияния, электрофизиологически доказанный К.М. McCarthy с соавторами (2009) (угол 125 между слившимися нейронами). Хотя такие двуядерные нейроны встречаются редко, иногда все же удается проследить сам процесс слияния нейроцитов. Вначале слияния клетки имеют 8-образную форму. В течение 10мин удается заметить динамику изменения формы нейрона и увеличение угла между клетками. Через 60-70мин нейроцит приобретает эллипсовидную форму, а через 90мин форма становится сферической. При этом отчетливо видны контуры двух ядер двуядерной клетки. Таким образом, предположение о том, что слияние клеток вызывает проназа, не соответствует как литературным данным, так и нашим экспериментам с протеолитическими ферментами.

К сожалению, отмеченные слившиеся нейроны и сам процесс слияния клеток непосредственно после выделения клеток наблюдаются редко. Однако, после тщательной промывки от проназы, спустя 2 суток пребывания нейронов в культуральной среде, отмечается значительное количество слившихся нейронов, углы слияния которых, гораздо больше 125. Это позволило нам предположить, что нейроны, используя собственные потенции к слиянию, способны образовывать синцитиальные цитоплазматические связи.

При ультраструктурном исследовании нейронов моллюска под влиянием проназы никакого массового формирования контактов или образования одиночных синцитиальных перфораций нами не было обнаружено. Структурные элементы нейрона сохраняли нормальное строение. Митохондрии, гранулярный и гладкий ЭПР, аппарат Гольджи, светлые и гранулярные везикулы, цитоплазма и структуры ядра были интактными. Контактирующие после центрифугирования мембраны клеток имели равномерные межклеточные щели около 20 нм. Поскольку не удалось обнаружить формирования типичных мембранных контактов и синцитиальных цитоплазматических перфораций, было сделано заключение, что сама обработка нейронов проназой не вызывает их слияния. Она только удаляет глиальные прослойки между телами нейронов.





Нами была предпринята попытка осуществить слияние нервных клеток моллюска общепринятым способом с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ), который является своеобразным полимером, вызывающим дегидратацию и слияние мембран. В этих экспериментах частично удалось получить одиночные картины адгезионных контактов и слияние нейронов. Однако при использовании расплавленного ПЭГ при температуре 32-34 С появляются множественные патологические выпячивания тела нейрона. С помощью латекса полистирола, сливающего мембраны ненервных клеток, также получены только одиночные слившиеся нейроны. Эксперименты с использованием латексных шариков, помещенных в культуральную среду, вызывали массовую агглютинацию клеток с шариками. Удаление ионов Са2+ и Mg2+ из среды позволило увеличить время взаимодействия латексных шариков с нейронами. Однако такая среда оказалась не безвредной: тела нейронов набухали и быстро разрушались.

Таким образом, испробованные нами способы синцитиального слияния нейронов с помощью ПЭГ и латексных шариков, широко применяемых для ненервных клеток, оказались мало пригодными для массового слияния нейронов беспозвоночных (моллюск). Поэтому потребовалась разработка специальной методики для слияния нейронов моллюска. Таким методом можно считать разработанный и запатентованный нами «Способ моделирования синцитиальных связей между нервными клетками in vitro».

Мы воспользовались нашими наблюдениями за слиянием одиночных нервных клеток на 2 сутки культивирования. Поскольку лишенные глии нейроны, тщательно отмытые от проназы, могли в культуральной среде на 2 сутки реализовывать собственные потенции к слиянию, то можно, используя это, попробовать смоделировать массовое целенаправленное слияние нейронов, обеспечив контакт между клетками.

На полутонких срезах, которые обычно изучают перед электронно-микроскопическими исследованиями, с помощью фазовоконтрастного микроскопа и дополнительного компьютерного контрастирования (эффекты Emboss и Solarise), удается обнаружить множественные общие для смежных клеток выпячивания (цитоплазматические мостики слияния) вдоль контактирующих краев нейронов (рис.2). Мостики слияния отделены друг от друга крупными вакуолеподобными образованиями, которые представляют собой локально резко расширенные фрагменты межклеточного пространства. Чередующиеся мостики слияния и вакулеоподобные образования располагаются на границе и являются абсолютным признаком слияния нейронов.

Это подтверждено в ходе электронно-микроскопических исследований. На рис. 3 воспроизведены те же вакуолеподобные расширения межклеточной щели и соприкасающиеся мостики слияния смежных нейронов. Хотя на некоторых электронных снимках мостики слияния двух контактирующих нервных клеток могут быть разделены их наружными мембранами, большинство мембран, разграничивающих цитоплазму соседних нейронов в области мостиков, расположенных между вакуолеподобными расширениями, оказываются разрушенными.

Рис. 2. Формирование трехядерного нейрона. Компьютерный эффект Emboss.

1–цитоплазматические мостики слияния; 2–вакуолеподобные расширения межклеточной щели; Н1, Н2, Н3–смежные нейроны; Я–ядро. Об. 40 Ph, ок. 10.

Вместо наружных клеточных мембран, разграничивающих цитоплазму нейроцитов, обнаруживаются только их короткие остаточные фрагменты с закругленными концами слившихся мембран, местами, сохранившие межклеточные щели шириной около 20 нм (рис.3). В остальных местах нейроплазмы смежных клеток непосредственно переходят друг в друга. Фактически речь идет о полном слиянии цитоплазмы двух соседних клеток в области мостиков слияния. Со временем количество вакуолеподобных расширений межклеточной щели уменьшается, и клетки сливаясь полностью, образуют двуядерный нейрон.

В специальной серии опытов мы также получили подробности слияния одиночных нейронов в культуральной среде с помощью цейтраферной видеосъемки. При исследовании нейронов в культуре ткани становится ясным, что в течении 30-50 часов живые нейроны сближаются, образуют контакты и затем сливаются. Понятен и механизм сближения нейронов. Он осуществляется в результате ретракции отростков одного нейрона, формирующего контакт с другим нейроном. Таким образом, в культуре изолированных нервных клеток можно продемонстрировать всю кинетику синцитиального слияния нейронов и образования таким способом двуядерных клеток.

Рис. 3. Разрушенные пограничные мембраны внутри мостика слияния двух нейронов.

1–цитоплазматические мостики слияния двух нейронов; 2–вакуолеподобные расширения межклеточной щели; 3–межклеточная щель; 4–цистерна эндоплазматической сети; 5–остаточные фрагменты разрушающихся мембран на границе двух нейронов; Н1, Н2–смежные нейроны; Я–ядро. Электронная микроскопия. Ув. 40000.

Тот факт, что нейроны сливаются, а не просто контактируют, указывают два абсолютных доказательства слияния нейронов. Во-первых, углы между телами нейроцитов больше 125, что свидетельствует, как доказано К.М. McCarthy с соавторами (2009) о слиянии клеток. Во-вторых, как нами показано с помощью электронного микроскопа, промежутки между вакуолеподобными структурами представляют собой мостики слияния, где разрушаются пограничные мембраны смежных клеток и их цитоплазмы сливаются.

Таким образом, в этих опытах впервые удалось смоделировать синцитиальную цитоплазматическую связь между нейронами in vitro и доказать их слияние, тем самым подтвердив принципиальное сходство нейронов с другими ненервными клетками в вопросе межклеточных взаимоотношений. Следовательно, по нашему мнению, окончательно решается главный вопрос дискуссии о принципиальной возможности синцитиальной цитоплазматической связи нейронов.

Для доказательства полноты свойства нейроллемы нейрона сливаться необходимо и достаточно доказать возможность слияния нейрона с изолированными фрагментами другой нервной клетки, выделенными специальными способами, как это ранее выполнено на многих ненервных клетках. Для этого было необходимо выделить ядро из целой клетки, а затем получить синцитиальное слияние изолированной цитоплазмы (цитопласт) с другим нейроном или соединение кариопласта с телом другого нейроцита.

Для получения цитопластов и кариопластов осуществляли энуклеацию нервной клетки с помощью цитохалазина В. При помещении диссоциированных нейронов в среду, содержащую цитохалазин, отмечали закономерное смещение ядра вплотную к наружной клеточной мембране (рис.4). Затем происходило его значительное выпячивание, и через 4-5 часов формировались цитопласт и кариопласт. При этом между ними в течение нескольких часов мог сохраняться цитоплазматический мостик.

Рис.4. Энуклеация нейрона с сохранением цитоплазматического мостика между карио- (1) и цитопластом (2).

a-г–стадии процесса. Время–от начала съемки. Фазовый контраст. Об. 20 Ph, ок. 10.

После эктопии ядра могут отмечаться множественные выпячивания цитоплазмы, маскирующие эктопию. Наряду с равномерным постепенным делением тела клетки на цитопласт и кариопласт нередки случаи, когда при четком выделении шарообразного кариопласта, цитопласт фрагментируется в виде множественных выпячиваний (рис.4, в, г). Иногда при их ампутации образуются изолированные цитопласты малого размера. Полное отделение ядра от цитоплазмы, то есть отдельные цитопласты и кариопласты на нейронах, были впервые массово получены после пипетирования энуклеированных клеток. При окраске цитопластов метиленовым синим обнаруживали массовое гранулообразование, что свидетельствует о жизнеспособности этих фрагментов. Для некоторых нейронов, примерно через 7-8 часов, при неполном разделении клетки характерно повторное округление. При этом ядро снова оказывается внутри тела нейрона, но это свойственно для претерминальных стадий жизни клетки.

В контрольной серии опытов с растворителем цитохалазина В ДМСО в течение 8 часов никаких существенных изменений нейронов не отмечали. Энуклеацию не наблюдали ни у одной нервной клетки. ДМСО в выбранной концентрации не препятствовал началу роста отростков у отдельных нейронов.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что выпячивание ядра нейронов, «перешнуровывание» нервных клеток и другие нейроморфологические феномены «деления нейронов», наблюдаемые при патологии и на «нормальном» материале могут быть воспроизведены на живых нейронах в эксперименте с цитохалазином B, изменяющим состояние цитоскелета. Эти феномены не являются истинным делением нейронов, а представляют собой естественный процесс эктопии ядра, заканчивающийся энуклеацией нейроцитов. Кроме того, впервые удается показать, что нервные клетки способны к энуклеации также как и клетки всех других типов. В отличие от эпителиальных клеток, энуклеация нейронов протекает легко. Следовательно, появляется возможность экспериментировать с получаемыми при энуклеации цито- и кариопластами.

Рис.5. Слияние цитопластов (1) между собой и с телом нейрона (2)

Я–ядро нейрона. Электронная микроскопия. Ув. 10000.

Эксперименты по слиянию цито- и кариопластов с телами нейронов проводили в 2-х сериях опытов. В первой – процесс слияния фрагментов и тел нервных клеток осуществлялся в течение 28 часов, а во второй серии – 56 часов. В обоих случаях было получено слияние цитопластов и кариопластов с телами нейронов и между собой (рис.5). При этом матрикс слившихся цитопластов обладал относительной плотностью. На периферии безъядерных фрагментов встречались вакуоли и лизосомоподобные гранулы, также как это обычно бывает при слиянии цитопластов с клетками других типов. В тонком слое цитоплазмы кариопластов располагались мелкие лизосомы и неизмененные ядра. Часть малых цитопластов сливалась с телами клеток, образуя мостики слияния и вакуолеподобные расширения межклеточной щели, как при слиянии тел нейронов. Эти структуры служат четким указателем процесса слияния цитопластов. При полном слиянии

цитопластов с цитоплазмой тела нейрона происходит редукция пограничных вакуолеподобных структур и цитопласт начинает напоминать выпячивание нейрона. Таким образом, уже через сутки контактирования интактных тел нейронов с цитопластами в культуральной среде отмечали слияние некоторых из них с образованием цибридов.

Вторая серия опытов отличалась от первой тем, что, помимо слияния цитопластов и кариопластов с телами клеток, встречались фигуры слияния цитопластов между собой и с кариопластами. При большом увеличении всегда прослеживали разрушение спаренных мембран тела нейрона и цитопласта. Так же, как и при слиянии тел нейронов, обнаруживали варикозную деформацию межклеточной щели и деструкцию пограничных мембран. Остаточные фрагменты мембран имели такие же округлые контуры или форму сфероидных остаточных телец. Таким образом, наши исследования впервые показали принципиальную возможность слияния ампутированного фрагмента нейроплазмы с телом (рис.5), метаболическим центром другой клетки. Это означает, что in vivo ампутированный отросток нейрона (то есть цитопласт) также теоретически может быть слит с новой клеткой.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ



Pages:     | 1 || 3 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.