WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Участие экзогенной днк в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных циклофосфаном и гамма-радиацией

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Лихачева Анастасия Сергеевна

УЧАСТИЕ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В РЕПАРАЦИОННЫХ

ПРОЦЕССАХ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ, ИНДУЦИРОВАННЫХ

ЦИКЛОФОСФАНОМ И ГАММА-РАДИАЦИЕЙ

03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН в лаборатории молекулярной биологии клетки, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Богачев С.С.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Демаков С.А.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,

г. Новосибирск

кандидат биологических наук

Елисафенко Е.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва

Защита диссертации состоится «7» апреля 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090

тел/факс: (383) 363-49-06 (1321); e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «__»___________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. История вопроса воздействия экзогенной ДНК на соматическую клетку и организм в целом относится к середине прошлого века. До настоящего времени в научной литературе имеется разрозненная информации о том, какие процессы в клетке вызывает проникновение фрагментов экзогенной ДНК во внутриклеточное пространство.

Судьба экзогенной ДНК, оказавшейся во внехромосомном пространстве ядра, принципиально имеет три исхода: (1) деградация фрагментов до мономеров, которые используются клеткой для синтетических процессов, (2) образование экстрахромосомных стабильно существующих и реплицирующихся вместе с геномом структур ДНК, (3) интеграция фрагментов в геном клетки.

В результате протекания первого пути – использование чужеродного генетического материала в качестве мономеров для синтетических процессов, протекающих в эукариотической клетке, – в структуре реципиентного генома не появляются молекулы чужеродного происхождения, несущие какую-либо генетическую информацию.

Второй путь – появление в клетке стабильно существующих, несущих структурно и функционально значимый генетический материал экстрахромосомных единиц, образованных объединением фрагментов экзогенной ДНК, доставленных в ядерное пространство. Процедура получения трансгенных как стабильно, так и транзитно трансформированных культур клеток широко используется в современной молекулярно-биологической практике. Экстрахромосомные структуры транзитно трансформированных клеток несут специфические вирусные последовательности, селективные и маркерные гены, позволяющие им реплицироваться и определенное время сохраняться в реципиентных клетках. Внехромосомная структура должна обладать последовательностью Ori репликации, воспринимаемой молекулярной синтетической машиной реципиентной клетки. При пролиферации определенной популяции клеток, содержащих такой стабильный автономно реплицирующийся генетический материал, он может выявляться в молекулярных экспериментах как структура, обладающая уникальными молекулярными характеристиками (размер, рестрикционная карта, содержание определенных специфических последовательностей).

Интеграция чужеродного генетического материала в реципиентный геном в форме индивидуальных, пришедших извне фрагментов ДНК является третьей из возможностей поведения чужеродной ДНК. Известно, что экзогенная ДНК экстрахромосомной локализации может интегрировать в геном клетки-реципиента двумя способами: гомологичной и негомологичной (незаконной) рекомбинацией (Wrtele et al., 2003). Интеграция с использованием механизма гомологичной рекомбинации зависит от репаративных факторов и достаточной гомологии между экзогенной ДНК и ДНК хромосомы (Takata et al., 1998; Smith, 2001; Wrtele et al., 2003). При интеграции по механизму незаконной рекомбинации экзогенная ДНК внедряется в негомологичные районы хромосом, используя объединение разорванных концов (Takata et al., 1998; Smith, 2001; Lee et al., 2005). Интеграции и появлению в геноме информации, исходно экзогенной локализации, путем гомологичной или незаконной рекомбинации, способствует наличие в клетке двухцепочечных разрывов (ДЦР) хромосом (Pques, Haber, 1999; Johnson, Jasin, 2000; Rodrigue et al., 2006).

В неповрежденной клетке с нормально функционирующими системами контроля прогрессии клеточного цикла интеграция экзогенной ДНК, по-видимому, происходить не может (Bergsmedh et al., 2002). Тем не менее, эксперименты по горизонтальному переносу генетического признака свидетельствуют о принципиальной возможности интеграции экзогенной ДНК в геном реципиентных клеток (Anker et al., 1980; Pulciani et al., 1982; Garca-Olmo et al., 1999; Holmgren et al., 1999; Garca-Olmo et al., 2000; Bergsmedh et al., 2002).



Предполагается, что фрагменты экзогенной ДНК могут интегрировать в геном в двух случаях. Во-первых, при нарушениях в системе, контролирующей прогрессию клеточного цикла, как, например, в случае неотрансформированных клеток (Holmgren et al., 1999; Bergsmedh et al., 2002; Yakubov et al., 2007). А во-вторых, при активированном состоянии репарационно-рекомбинационной машины клетки, например, при появлении ДЦР в молекуле ДНК хромосомы или при интеграции вирусной ДНК.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы является:

Характеристика явлений, связанных с участием фрагментов экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных -радиацией и кросслинкирующим цитостатиком циклофосфаном (ЦФ).

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать радиопротекторное действие экзогенной ДНК при ее введении в организм экспериментальных животных после летальных доз -облучения.
  2. Исследовать совместное действие на организм мышей цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК.
  3. Определить возможность поглощения экзогенной ДНК стволовыми клетками, растущими в культуре.
  4. Изучить проникновение экзогенной ДНК в клетки костного мозга при введении в организм экспериментальных животных.
  5. Провести молекулярно-генетический анализ геномной ДНК экспериментальных животных после совместного воздействия ЦФ и экзогенной ДНК.

Научная новизна. Впервые обнаружено, что экзогенная ДНК проявляет радиопротекторное действие при ее введении в организм экспериментальных животных в строго определенный момент времени после летальных доз -облучения. Этот промежуток времени составляет 5-30 мин после быстрого (5-10 мин) набора организмом летальной дозы -радиации. Впервые показано, что инъекции экзогенной ДНК человека мышам, подвергшимся сублетальной дозе -облучения, приводят к формированию селезеночных колоний, которые являются потомками стволовых клеток крови.

Впервые обнаружен феномен гибели мышей при введении цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК в определенный момент времени. Максимальный летальный эффект наблюдается при введении ДНК каждый час в период 18-30 ч после ЦФ.

Практическая значимость. Результаты данной работы могут быть использованы для дальнейших исследований воздействия экзогенной ДНК на организм высших эукариот, включая человека, а также для изучения участия экзогенной ДНК в репарационных процессах. Обнаруженный феномен истинного или транзитного трансгенеза чужеродным генетическим материалом при совместном воздействии экзогенной ДНК и агента, вызывающего появление ДЦР хромосомы, может стать новым направлением в генной терапии человека и животных.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Экзогенная ДНК в виде фрагментов доставляется в стволовые клетки костного мозга мышей и депонируется во внехромосомном пространстве ядра.
  2. Инъекции экзогенной ДНК смертельно облученным мышам приводят к спасению экспериментальных животных. Радиопротекторное действие экзогенной ДНК проявляется при ее введении в организм экспериментальных животных в течение 5-30 мин после быстрого (5-10 мин) набора летальной дозы -радиации и связано с формированием селезеночных колоний.
  3. Введение мышам цитостатика ЦФ и следующие за этим в определенный момент времени инъекции экзогенной ДНК приводят к гибели экспериментальных животных. Во фракции геномной ДНК некоторых соматических тканей погибших мышей обнаруживаются стабильно присутствующие фрагменты чужеродной ДНК.

Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г.), Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008» (Томск, 16-19 сентября 2008 г.) и Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-27 июня 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 – в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа с культурой эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) проводилась совместно с к.б.н. М.А. Прохорович. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством к.м.н. В.П. Николина и к.б.н. Н.А. Поповой. Подсчет форменных элементов крови проводился совместно с Т.Д. Дубатоловой.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах, содержит 26 рисунков и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препарат ДНК человека

Препарат человеческой ДНК получали из плацент здоровых рожениц, результаты анализа крови которых отрицательны на наличие ВИЧ, сифилиса, гепатитов В и С. Для выделения ДНК использовали безфенольный метод (раздел промышленного регламента производства препарата «Панаген»). Фрагментацию ДНК осуществляли ультразвуковым дезинтегратором при частоте 22 КГц, в результате чего получали набор фрагментов ДНК, большая часть которых имела размеры от 200 до 6 000 п.н. Препарат ДНК хранили при –20оC. Данный препарат является фармакопейным препаратом (патентованное название «Панаген», регистрационное свидетельство ЛСР №004429/08 от 09.06.2008) и в качестве объекта промышленной собственности принадлежит ООО «Панаген».





Экспериментальные животные

В экспериментах использовали трехмесячных мышей линии CBA/Lac разводки вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в пластиковых клетках по 10 особей в каждой со свободным доступом к пище и воде. Мыши получали гранулированный корм ПК120-1 (Лабораторснаб, Москва).

Эксперименты по радиопротекции

В экспериментах по радиопротекции мышей облучали на -установке ИГУР-1 (Cs137). Дозы облучения составляли 9,5-9,6 Гр, мощность 1,3-1,4 Гр/мин. Животные получали внутрибрюшинные (в/б) инъекции 0,5-1 мг препарата ДНК человека или ДНК мышей СВА в различное время до и после облучения. Контрольные группы получали инъекции физиологического раствора по тем же схемам. В экспериментах регистрировали продолжительность жизни мышей.

В одном из экспериментов мыши получали сублетальную дозу облучения 8,21 Гр при мощности 1,3 Гр/мин и инъекции 1 мг ДНК человека за 30 мин до облучения и по 0,5 мг ДНК через 30 мин и следующие 2 дня после облучения. На 10-й день после облучения животные были забиты. Выделенные селезенки помещали в фиксатор (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты, 90 мл 70% этилового спирта) и считали количество селезеночных кроветворных колоний.

Введение мышам ЦФ и ДНК человека

ЦФ вводился в/б мышам (n=20) из расчета 200 мг/кг веса. Одной группе мышей (n=10) за 30 мин до введения препарата в/б вводили 1 мг ДНК человека, через 30 мин после инъекции ЦФ вводили еще по 0,5 мг ДНК и столько же на 2-й и 3-й день. Аналогично контрольным мышам (n=10) вместо ДНК вводили физиологический раствор.

Схемы дальнейших экспериментов по введению мышам ЦФ совместно с экзогенной ДНК приведены на рисунке 3.

Статистическая обработка данных выживаемости мышей в проведенных экспериментах по совместному введению ЦФ и экзогенной ДНК, выявляющая достоверные различия между группами мышей, проводилась при помощи однофакторного дисперсионного анализа с использованием критерия Фишера.

Культивирование ЭСК человека

Колонии ЭСК человека линии hESMO1 культивировали на желатинизированных 35 мм чашках Петри (Costar) при 37°С в атмосфере 6,5% СО2 в среде KODMEM (Invitrogen) с использованием фидера из митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов. Количество клеток, находившихся в одной чашке Петри, составляло в среднем 0,5106.

В чашку Петри с клетками линии hESMO1 добавляли 5 мкг меченой 32P ДНК плазмиды плазмиды Carnegie 20-1,4(8) (Baricheva et al., 1996). Время инкубации клеток с меченой ДНК составляло 0, 1, 2 и 3 часа.

Из клеток выделяли ядра путем центрифугирования на ступенчатом градиенте 10% сахарозы (Drosophila…, 1986). Из цитоплазматической фракции осаждали ДНК. Ядра заливали в блоки легкоплавкой агарозы (1%, ТАЕ буфер) объемом 80 мкл и хранили в 20 мМ ЭДТА в течение нескольких дней (Schwartz, Cantor, 1984). В одном агарозном блоке содержалось порядка 250 000 ядер. Перед электрофорезом ядра, фиксированные в агарозе, обрабатывали 1% SDS, 20 мМ ЭДТА и 200 мкг/мл протеиназы К в течение 2 часов при 37°С и отмывали в ТЕ буфере трехкратно по 10 мин. Материал ДНК цитоплазмы и ядра фракционировали в 1% агарозном геле. Агарозный гель высушивали под струей горячего воздуха и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Введение мышам ДНК

Мышам в/б вводили 0,5 мг ДНК человека, фрагментированной до размеров 200 – 6 000 п.н., каждый час в течение 12 часов. Через 8 часов мышей забивали и выделяли клетки костного мозга. Появление ДНК человека в клетках костного мозга мышей детектировали методом ПЦР на предметных стеклах (Cycling PRINS) либо ПЦР амплификацией ДНК ядерного материала клеток с праймерами на уникальный ген каспазы 3 человека.

ПЦР на предметных стеклах

Приготовление препаратов ядер клеток костного мозга проводили по стандартной методике (Stanyon, Galleni, 1991; Gosden, Lawson, 1995).

Реакцию проводили в 50 мкл: 0,5 мкг праймера – ДНК человека, фрагментированной до размеров 20 – 500 п.н., 0,2 мМ dATP, dGTP и dCTP, 0,02 мМ dTTP, 0,02 мМ biotin-16-dUTP, 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 мМ MgCl2, 0,1% BSA, 5 ед. Taq-полимеразы (Gosden, Lawson, 1995). На предметные стекла наносили реакционную смесь, накрывали препарат покровным стеклом и закрепляли резиновым клеем, чтобы не происходило испарения.

Для амплификации использовался следующий температурный режим: (63°С – 3 мин, 73°С – 10 мин) – 1 цикл, (98°С – 1 мин, 63°С – 1 мин, 73°С – 3 мин) – 30 циклов. Амплификацию проводили на приборе Mastercycler personal (Eppendorf, США).

Для детекции (Pinkel et al., 1986) использовали конъюгат авидин-FITC (Vector Laboratories, США), и антитела к авидину, меченые биотином (Vector Laboratories, США).

Флуоресцентная микроскопия проводилась на микроскопе Axioskop 2 Plus с использованием программы AxioVision в Центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН.

Полимеразная цепная реакция

Реакцию проводили в 100 мкл: 0,2 мкг ДНК-матрицы, по 40-50 пмоль праймеров, 0,2 мМ dNTPs, 1,5-2,5 мМ MgCl2, 5 ед. Таq-полимеразы (Медиген, Новосибирск) (PCR Application Manual, 1995).

Используемые праймеры на ген каспазы 3 человека:



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.