WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

НЕПША

ОКСАНА СЕРГЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ВАГИНИТАХ

03.03.03 – иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва, 2012 г.

Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России и ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Научный руководитель: Трофимов Дмитрий Юрьевич, доктор биологических наук.
Официальные оппоненты: Яздовский Виктор Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией, ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф.Владимирского»,
Винницкий Леонид Ильич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией, ФГБУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» РАМН.
Ведущая организация: Факультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «МГУ имени М.В.Ломоносова».

Защита состоится 26 декабря 2012 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу:

115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан ноября 2012 г.

Ученый секретарь

Совета по защите докторских и

кандидатских диссертаций

доктор медицинских наук Сеславина Лия Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема инфекционно-воспалительных заболеваний женской репродуктивной системы продолжает оставаться одной из самых важных в акушерско-гинекологической практике. В настоящее время, наряду со снижением роли абсолютных патогенов в развитии инфекционно-воспалительных процессов влагалища, все большее значение в патогенезе таких заболеваний приобретают микроорганизмы, относящиеся к группе условно-патогенных: бактерии, грибы, микоплазмы, являющиеся составной частью нормальной микрофлоры [Липова E.B., 2009; Ширева Ю.В., 2010].

Заболевания урогенитального тракта, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), принято рассматривать как дисбаланс биоты – дисбиоз [Болдырева М.Н., 2009]. Нарушение нормальной микрофлоры влагалища в большинстве случаев связано с развитием локального инфекционно-воспалительного процесса, характеризующегося рядом различных клинических проявлений: от бессимптомного носительства (например, кандидоносительство, мико-, уреаплазменная инфекция) до развернутой картины воспаления. Практическая диагностика таких состояний влагалища вызывает значительные трудности.

С развитием молекулярно-генетических методов, в частности количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественной ПЦР-РВ), задачи лабораторной диагностики дисбиотических состояний решаются более успешно [Ворошилина Е.С., 2011].

Остается нерешенным вопрос определения степени реактивности и динамического изменения компонентов локального иммунитета при воспалительных состояниях, обусловленных, в том числе, и дисбиотическими нарушениями. Оценка локального иммунитета слизистой влагалища в рутинной практике в настоящее время осуществляется в большинстве случаев единственным способом - путем подсчета количества лейкоцитов в поле зрения микроскопа в нативном материале. Ввиду многообразия микроорганизмов и многогранности иммунного ответа, единичный показатель - количество клеток - не отражает в полной мере состояние мукозального иммунитета и является малоинформативным. Кроме того, результаты данного теста являются достаточно субъективными и во многом зависят от квалификации врача клинической лабораторной практики [Дмитриев Г.А., 2010; Schwiertz A. et. al., 2006]. В связи с этим установление объективных маркеров, способных более полно отразить состояние локального иммунитета является крайне актуальным.

На сегодняшний день в научной литературе существует большое количество информации относительно диагностической и прогностической значимости иммунологических показателей в алгоритме диагностики воспалительных состояний влагалища [Campos A. et. al., 2012; Hickey D. et. al., 2011]. Однако данные научные наработки до сих пор не нашли широкого применения в практике врачей акушеров-гинекологов.



В настоящее время к генам, контролирующим иммунный ответ, наряду с генами главного комплекса гистосовместимости относят широкий спектр генов, участвующих в его регуляции.

Учитывая преимущества метода ПЦР-РВ, а именно: его быстроту (в среднем для проведения анализа биологического материала методом ПЦР необходимо от 2-х до 4-х часов) и объективность, перспективным является изучение транскриптов (мРНК) генов иммунного ответа непосредственно в тканях, что позволит дать оценку динамическому состоянию организма, которое является результатом взаимодействия его генотипа, фенотипа и факторов внешней среды.

Результатом совместного использования современных молекулярно-генетических методов оценки экспрессии генов иммунного ответа и методов математической статистики, может явиться новый способ диагностики локального воспаления слизистой влагалища, который будет отражать состояние местного иммунитета.

Цель работы: изучить молекулярно-генетические особенности местного иммунитета при вагинитах у беременных и небеременных женщин и оценить возможность использования транскрипционного профиля генов иммунного ответа для совершенствования методов диагностики локального воспаления.

Задачи

  1. На основании клинической картины у небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин перед родами и оценки состояния биоценоза влагалища методом ПЦР-РВ сформировать исследуемые группы.
  2. С помощью количественной ПЦР-РВ и метода обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) охарактеризовать и сравнить профиль представленности транскриптов генов цитокинов (IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL15, IL18, IL23, TNFА, IFNG, TGFB1 и LIF), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, FOXP3 и RORC), Toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), поверхностных клеточных молекул (CD45, CD68, CD69, IL2RА) и гранулизина (GNLY) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.
  3. Сравнить профиль экспрессии исследуемых генов иммунного ответа в клетках слизистой влагалища в группах здоровых беременных и здоровых небеременных женщин.
  4. На основании количественной оценки транскриптов в клетках вагинальных соскобов отобрать наиболее информативные гены для оценки состояния слизистой влагалища.
  5. Выявить роль изменений локального иммунитета влагалища в развитии осложнений родового акта и послеродового периода.
  6. На основании экспериментальных данных и методов математической статистики предложить диагностическую модель оценки воспалительных состояний влагалища, основанную на определении количества мРНК генов иммунного ответа.

Научная новизна. Впервые получены данные об уровне экспрессии мРНК широкого спектра генов иммунного ответа (IL1В, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL15, IL18, IL23, IL2RA, GNLY, TNFA, TGFB1, LIF, IFNG, TLR2, TLR4, TLR9, TBX21, GATA3, RORC, FOXP3, CD45, CD68, CD69) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.

Выявлена ассоциация экспрессии 14 генов (IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFА, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC) из 24 исследуемых с проявлением местного воспаления.

В результате количественной оценки транскриптов генов провоспалительных цитокинов IL12A и IL18, а также общего макрофагального рецептора CD68 и основного транскрипционного фактора Th2-клеток GATA3 показано достоверное снижение экспрессии этих генов в клетках слизистой влагалища при наличии местного воспаления, что не согласуется с представлениями классической иммунологии.

Разработан метод диагностики локального воспалительного процесса, протекающего на слизистых влагалища, на основании определения количества транскриптов генов IL1B, IL18, IL10, TLR4, CD68 и GATA3 для беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста.

Практическая значимость. Установлены маркеры воспалительного процесса. При вагинитах в клетках слизистой влагалища беременных и небеременных женщин повышается количество транскриптов генов IL1B, IL8, IL10, TNFA, TLR2, TLR4, CD45, CD69, а количество транскриптов генов GATA3, CD68, TGFB1, IL12A, RORC, IL18 уменьшается.

Предложен новый метод диагностики локального воспаления с использованием значений количества мРНК генов IL1B, IL18, IL10, CD68, TLR4 и GATA3 с чувствительностью и специфичностью в области порогового значения 96% и 95% соответственно как для беременных женщин, так и для небеременных женщин.

Создана основа для разработки диагностических тест-систем с использованием предложенной модели.

Показана возможность практического использования разработанного метода для диагностики локального воспалительного процесса во влагалище в практике акушеров-гинекологов.

Определены перспективы практического использования ОТ-ПЦР для оценки состояния локального иммунитета путем измерения мРНК генов иммунного ответа: учитывая схожее строение слизистых оболочек организма, полученные результаты могут быть перенесены на другие участки слизистых, что позволит расширить границы применения полученных результатов.

Показано, что наличие местной воспалительной реакции, определяемое по профилю экспрессии генов иммунного ответа, является важным диагностическим критерием, позволяющим объективно разграничить бессимптомное носительство условно-патогенной микрофлоры от проявлений вагинита.





Внедрение в клиническую практику современных методов исследования локального иммунитета влагалища у беременных женщин перед родами позволит объективно оценить наличие или отсутствие воспалительной реакции, а также своевременно предпринять меры по профилактике послеродовых воспалительных осложнений.

По результатам диссертационной работы подана заявка на изобретение № 201147924 «Способ диагностики вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках».

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций. Материалы исследований были представлены на Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011г.), VI Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012г.), V Российской конференции "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012г.).

Диссертация частично выполнена в рамках работ по государственному контракту №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011г.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 74 русскоязычных источника и 123 источника на иностранном языке. Работа содержит 11 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе диссертационной работы был исследован биологический материал от 295 пациенток, полученный в клиническом отделении ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в рамках выполнения государственного контракта №16.522.12.2009. Среди обследованных было 194 небеременные женщины в возрасте от 19 до 45 лет и 101 беременная женщина в возрасте от 18 до 40 лет в сроках от 37 до 41 недель беременности без родовой деятельности с целым плодным пузырем.

Материалом для исследования служили соскобы слизистой с задних и боковых стенок влагалища.

Критерием включения в группы здоровых беременных и здоровых небеременных женщин было отсутствие жалоб на момент обследования, отсутствие клинических признаков воспаления, лейкоцитарной реакции и дисбиотических нарушений биоценоза влагалища, наличие абсолютного нормоценоза.

Критерием включения в группы беременных и небеременных женщин с вагинитами было наличие жалоб, отечности и гиперемии со стороны слизистой влагалища, выраженной воспалительной реакции, которая подтверждалась лейкоцитарной реакцией (более 10 лейкоцитов в поле зрения микроскопа).

Критерием исключения было наличие абсолютных патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium) и ВПГ 1 и 2 типа, а также применение антибактериальных препаратов менее, чем за месяц до исследования. В отношении беременных женщин критериями исключения также являлись наличие у пациенток тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии, истмико-цервикальная недостаточность с ее хирургической коррекцией.

На основании клинико-анамнестических данных и результатов лабораторного исследования биоценоза влагалища методом «Фемофлор» беременные и небеременные пациентки были разделены на несколько групп сравнения. Формирование лабораторного заключения по результатам исследования методом «Фемофлор» (№ ФСР 2009/04663) было основано на критериях, разработанных Е.С. Ворошилиной и соавт. (2011).

Небеременные женщины (n=194) были разделены на следующие группы: группа здоровых небеременных женщин (n=40), группа небеременных женщин с вагинитами (n=115); дополнительно были выделены группы женщин с незначительной выраженностью воспаления и числом лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения: группа женщин с кандидоносительством (n=14), количество Candida spp. более 103 геномэквивалент/мл (гэ/мл) на фоне сохраненной нормофлоры, группа женщин с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл (n=10) на фоне сохраненной нормофлоры и группа женщин с облигатно-анаэробным дисбиозом (n=15).

Беременные женщины (n=101) были разделены на следующие группы: группа здоровых беременных женщин (n=42), группа беременных женщин с вагинитами (n=24); дополнительно были выделены группы женщин с незначительной выраженностью воспаления и числом лейкоцитов менее 10 в поле зрения: группа женщин с кандидоносительством (n=11), количество Candida spp. более 103  гэ/мл на фоне сохраненной нормофлоры, группа женщин с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл (n=16) на фоне сохраненной нормофлоры и группа женщин с обильными выделениями из половых путей (n=8). Эта группа интересна тем, что проблема интерпретации наличия обильных выделений (состояние физиологической нормы или патология) у беременных женщин является актуальной, т.к. до сих пор нет четкого понимания в отношении назначения профилактической терапии.

Микроскопический метод. Микроскопию вагинальных мазков, окрашенных по Граму, проводили по стандартной методике [Анкирская А.С., 2009]. Учитывали: характер вагинального эпителия, наличие «ключевых клеток», количество лейкоцитов, общую микробную обсемененность, морфологический состав микрофлоры, наличие дрожжеподобных грибов.

Исследование микрофлоры влагалища методом ПЦР-РВ. Взятие биологического материала осуществляли в пробирки с физиологическим раствором. Осаждение клеток и бактериальных агентов проводили путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 10 минут. Полученные клетки ресуспендировали в 100 мкл физиологического раствора. Для выделения ДНК использовали наборы «Проба ГС» («ДНК-Технология», Россия). Объем образцов после выделения составил 100 мкл.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.