WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 || 3 |

Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах

-- [ Страница 2 ] --

Методом ПЦР-РВ проводилась количественная оценка биоценоза влагалища с помощью комплекта реагентов «Фемофлор» («ДНК-Технология», Россия): учитывали общее количество бактерий (общая бактериальная масса (ОБМ)), количество Lactobacillus spp. и 14 основных групп УПМ, включая аэробные микроорганизмы (Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp.), облигатно-анаэробные (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae), Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp. и Candida spp.

Амплификацию осуществляли на приборе «ДТ-964» («ДНК-Технология», Россия) в режиме реального времени согласно инструкции производителя.

Формирование лабораторного заключения по результатам исследования методом «Фемофлор» было основано на критериях, разработанных Е.С. Ворошилиной и соавт. (2011), а также на основании методического пособия для врачей «Фемофлор» от фирмы-производителя.

Под абсолютным нормоценозом понимали вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры (Lactobacillus spp.) в его составе была более 80% по отношению к ОБМ, количество Ureaplasma spp., M. hominis – менее 104 гэ/мл, Candida spp. – менее 103гэ/мл. Условный нормоценоз расценивали как вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры в его составе была более 80%, но количество Ureaplasma spp., M. hominis – могло быть более 104 гэ/мл и/или количество Candida spp. – более 103гэ/мл. Под анаэробный и аэробным дисбиозом понимали дисбаланс биоты, обусловленный одним или несколькими анаэробными и аэробными УПМ соответственно в количестве более 20% по отношению к ОБМ, и долей нормофлоры менее 80%. Смешанный дисбиоз - дисбаланс, вызванный сочетанием бактериальной аэробной и/или анаэробной биоты, возможно, в сочетании с Candida spp. на фоне снижения количества нормофлоры.

Исследование профиля мРНК генов иммунного ответа методом ОТ-ПЦР. Для изучения состояния местного иммунитета определяли представленность транскриптов генов цитокинов (IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL15, IL18, IL23, TNFА, IFNG, TGFB1, LIF), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, FOXP3, RORC), Toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), поверхностных клеточных молекул (CD45, CD68, CD69, IL2RA) и гранулизина (GNLY) в клетках слизистой влагалища. Во избежание деградации РНК взятие материала осуществляли в пробирки со специальной транспортной средой (лизирующий раствор набора «Проба НК», «ДНК-Технология», Россия). Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками промывочными растворами. Объем образцов после выделения составил 50 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) ставили в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). В качестве праймеров для ОТ использовали специфичные олигонуклеотиды. Реакцию проводили при температуре 40С в течение 30 мин, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95С в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ кДНК разводили в 5 раз в ТЕ-буфере. Амплификацию осуществляли на приборе «ДТ-964» («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции производителя. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки.

Статистическая обработка результатов. Для количественной оценки уровня экспрессии мРНК генов применялся метод сравнения индикаторных циклов (метод Cq) с нормировкой по трем референсным генам TBP, B2M, GUS.

В качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки – верхний (H) и нижний квартили (L). Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна-Уитни для несвязанных совокупностей. Значения Ме в контрольной группе были приняты за 1, а значения Ме в исследуемых группах показывала во сколько раз уровень экспрессии гена выше или ниже по отношению к группе здоровых пациенток.

Отношение шансов (ОШ) и значимость различий в частоте встречаемости качественных признаков рассчитывали с помощью программного продукта WINPEPI. ОШ приведено с 95% доверительным интервалом. Cтатистическую обработку данных проводили с помощью статистического пакета SPSS Statistics версии 17.0 (Inc., Chicago, USA).

При разработке критериев диагностики вагинита был проведен многофакторный анализ и построена математическая модель, позволяющая вычислить значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) для каждого клинического образца. С использованием полученной функции была построена классификационная модель. Для расчёта оптимального значения величины порога отсечения (точки cut off) использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic). Основой данного анализа является построение ROC-кривой, которая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. Критерием выбора точки cut off является требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование микрофлоры влагалища небеременных женщин методом ПЦР-РВ. По типу биоценоза у обследованных небеременных женщин репродуктивного возраста наблюдалось преобладание нормофлоры. Из 194 пациенток нормоценоз был выявлен у 128 (66%), из них абсолютный нормоценоз - у 62 (48,4%), а условный – у 66 (51,6%).





Среди женщин с абсолютным нормоценозом (n=62) доля УПМ не превышала 6%, доля лактобактерий была не ниже 94%, микоплазм и грибов Candida spp. выше диагностического порогового уровня (104 гэ/мл для микоплазм и 103 гэ/мл для грибов) выявлено не было.

Из 66 женщин с условным нормоценозом у 28 (43,5%) Ureaplasma spp. превышала пороговое значение 104 гэ/мл, а у 56 (84,8%) Candida spp. обнаруживалась в количестве более 103 гэ/мл, при этом у 18 женщин (28,1%) одновременно были повышены количества обоих микроорганизмов. Доля УПМ среди женщин с условным нормоценозом не превышала 15% по отношению к ОБМ. Доля нормофлоры была не ниже 80%.

У 66 (34%) из 194 пациенток были выявлены дисбиотические нарушения влагалища, которые характеризовались значительным снижением нормофлоры от 75% до 1% против 94% у женщин с нормоценозом. Из них у 8 (12,1%) наблюдался аэробный дисбиоз. Доля нормофлоры была снижена от 62% до 1%. Доля всех УПМ в среднем составляла от 30% до 99% по отношению к ОБМ. Группа женщин с данным дисбиозом по сравнению с женщинами с нормоценозом характеризовалась наибольшим увеличением количества факультативных аэробов семейств Streptococcus spp. от 30% до 80% и Enterobacterium spp. от 30% до 99%. У 3 пациенток были выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 гэ/мл.

Среди пациенток с дисбиотическими нарушениями (n=66) у 30 (45,5%) был выявлен облигатно-анаэробный дисбиоз. Доля УПМ составляла более 20% по отношению к ОБМ. Количество лактобактерий было снижено от 79% до 1% по отношению к ОБМ. Данное дисбиотическое нарушение характеризовалось преобладанием следующих групп микроорганизмов: Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. от 20 до 99%, Eubacterium spp. от 20 до 30%, Lachnobacterium spp./Clostridium spp. от 25 до 99%, Atopobium vaginae от 20 до 80%, Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. от 20 до 40% по отношению к ОБМ. У 21 женщины была выявлена Ureaplasma spp, у 5 – M. hominis в количестве более 104 гэ/мл.

У 28 из 66 женщин (42,4%) с дисбиотическими нарушениями наблюдался смешанный вариант биоценоза, где присутствовали облигатно-анаэробные и/или аэробные микроорганизмы в количестве более 20% по отношению ОБМ, а также Candida spp. в количестве более 103 гэ/мл. Общее содержание лактобактерий не превышало 50% в сравнении с ОБМ. Данная группа характеризовалась увеличением количества облигатно-анаэробных микроорганизмов от 32 до 99% и аэробных – от 20 до 80%. У 3 женщин была выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 гэ/мл, а у 18 - Candida spp. в количестве более 103 гэ/мл.

По структуре биоценоза в группе небеременных женщин с вагинитами (n=115) различали несколько вариантов состояния биоценоза: абсолютный нормоценоз (n=22), условный нормоценоз, характеризующийся увеличением количества Candida spp. (n=42), аэробный дисбиоз (n=8), облигатно-анаэробный дисбиоз (n=15) и смешанный дисбиоз (n=28).

Исследование микрофлоры влагалища беременных женщин методом ПЦР-РВ. По типу биоценоза у обследованных беременных женщин (n=101) наблюдалось преобладание нормофлоры. Нормоценоз был выявлен у 95 беременных женщин (94%). При этом абсолютный нормоценоз влагалища выявлен у 59 (62,1%), а условный – у 36 пациенток (37,9%).

Из 36 женщин с условным нормоценозом у 18 (50%) количество Ureaplasma spp. превышало 104 гэ/мл, а у 20 (55,6%) - была обнаружена Candida spp. в количестве более 103 гэ/мл, у 2 женщин одновременно были повышены количества обоих микроорганизмов.

Дисбиотические нарушения влагалища были выявлены у 6 (5,9%) пациенток из 101. Наблюдалось значительное снижение доли нормофлоры – количество лактобактерий при дисбиозе не превышало 60%. Группа женщин с данным типом биоценоза по сравнению с группой женщин с абсолютным нормоценозом характеризовалась увеличением количества факультативных аэробов: семейство Streptococcus spp. до 30% и Enterobacterium spp. до 25%.

Смешанного типа дисбиоза, а также облигатно-анаэробного среди беременных женщин выявлено не было.

По структуре биоценоза в группе беременных женщин с вагинитами (n=24) различали: абсолютный нормоценоз (n=9), условный нормоценоз (n=9), характеризующийся наличием Candida spp. более 103 гэ/мл, и аэробный дисбиоз (n=6).

Частота встречаемости Ureaplasma spp. и Candida spp. не зависела от наличия лактобактерий, что соотносится с данными литературы [Zhou H. et al., 2006; Прилепская В.Н., 2010].

Исследование профиля экспрессии мРНК генов иммунного ответа методом ОТ-ПЦР. Одной из ключевых характеристик клеток организма является профиль экспрессии генов, описывающий их состояние и функциональную активность. Для оценки профиля экспрессии генов была использована технология анализа количества мРНК в образцах относительно референсных генов (TBP, B2M, GUS) с помощью реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени. Для определения состояния локального иммунитета влагалища у всех женщин был проведен анализ экспрессии генов IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL15, IL18, IL23, TNFА, IFNG, TGFB1, LIF, TBX21, GATA3, FOXP3, RORC, TLR2, TLR4, TLR9, CD45, CD68, CD69, IL2RA и GNLY.

Наличие локальной воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища в группах беременных и небеременных женщин с вагинитами характеризуется достоверным повышением экспрессии генов TLR2, TLR4, IL1B, IL6, IL8, GNLY, TBX21, IFNG, IL10, CD45, IL2RA и CD69 (p<0.05) в сравнении со здоровыми женщинами. Увеличение количества транскриптов генов TLRs, провоспалительных цитокинов, а также маркеров активированных Т-клеток и транскрипционного фактора TBX21 при вагинитах свидетельствует об активации клеток врожденного и адаптивного иммунитета, что подтверждается данными ряда авторов [Wirth M., 2007; Anton G. et al., 2008].

В эпителиальном слое слизистой оболочки влагалища в норме содержатся дендритные клетки, Т-лимфоциты, а при воспалении туда мигрируют другие популяции клеток (CD8+-Т-клетки, NK-клетки). Состав популяции клеток иммунной системы в подслизистом слое более разнообразен (макрофаги, нейтрофилы, типичные Т- и В-лимфоциты, дендритные клетки, NK-клетки). Об активации лимфоцитарного звена иммунной системы говорит повышение экспрессии мРНК общего лейкоцитарного антигена CD45, раннего активационного антигена Т-лимфоцитов CD69, а также IL2RA, экспрессирующихся на активированных Т-клетках [Pudney J. et al., 2005; Ярилин А.А., 2010].

При вагинитах у беременных и небеременных женщин отмечалось достоверное снижение уровня экспрессии мРНК генов IL12A, IL18, CD68, а также GATA3 и RORC и увеличение IL10 по сравнению с соответствующими группами контроля.

По данным ряда авторов [Strobl H., 2004; Rydstrm A., 2007] CD68 экспрессируется помимо активированных макрофагов и на некоторых популяциях дендритных клеток. Являясь профессиональными антигенпрезентирующими клетками, при активации они мигрируют в региональные лимфатические узлы для представления антигена наивным Т-клеткам, что способствует их последующей дифференцировке. Принимая во внимание достоверное повышение количества мРНК TBX21 при вагинитах, ожидалось, что экспрессия IL12А и IL18, необходимых для дифференцировки Th0-лимфоцитов в Th1-клетки и их клональной пролиферации, будет повышена. Снижение количества транскриптов IL12A, IL18 и CD68 может быть вызвано тем, что данные события осуществляются в региональных лимфоидных органах, а не локально [Cunningham A. et al., 2013].

Транскрипционный фактор GATA3, помимо регуляции дифференцировки Т-клеток по Th2-пути, играет важную роль в биологии эпителиальных клеток. Снижение уровня транскрипта гена GATA3 вероятно связано с физиологическими процессами слущивания и обновления вагинального эпителия при развитии локального воспаления [Kurek D. et. al., 2008]. Возможно, этими же физиологическими процессами объясняется и снижение экспрессии гена TGFB1 при воспалении, который участвует в дифференцировке эпителиальных клеток [Juuti-Uusitalo K.  et. al., 2006].

Согласно современным представлениям, основными клетками-продуцентами IL10 являются макрофаги, дендритные клетки, В-клетки, а также различные субпопуляции Т-клеток. IL10, являясь регуляторным цитокином, может напрямую регулировать врожденный и адаптивный ответы макроорганизма на вторжение инфекционного агента, и по принципу обратной связи ограничивать развитие локального воспалительного процесса [Kevin N. et. al., 2008].

Провоспалительная функция IL10 также реализуется в отношении Th17-клеток путем подавления их дифференцировки. Вероятно, по этой причине детектировалось достоверное снижение экспрессии гена RORC при вагинитах [Frank L. van de Veerdonk et. al., 2009].

Среди беременных женщин с вагинитами отмечено увеличение количества транскриптов генов IL6, LIF, IL15, GNLY и IFNG (p<0.05) по сравнению с группой здоровых беременных женщин. Также, следует отметить, что уровень экспрессии этих генов в мазках беременых женщин был выше в сравнении с небеременными. Эти данные косвенно свидетельствуют об активации NK-клеток, необходимых для поддержания нормально протекающей беременности и развития плода [Piccinni Marie-Pierre, 2006].

Группа небеременных женщин с кандидоносительством (n=14) мало отличалась от группы здоровых небеременных женщин по уровню экспрессии исследуемых генов, за исключением TGFB1, экспрессия которого была повышена в 2 раза. Среди беременных женщин с кандидоносительством (n=11) отмечалось достоверное снижение экспрессии генов IL8, IL18, TGFB1, GATA3, RORC, LIF и повышение IL6 и IL10 (р<0,05).

Группа небеременных пациенток с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл (n=10) по профилю экспрессии анализируемых генов была сходна с группой небеременных женщин с вагинитами и характеризовалась достоверным повышением экспрессии генов TLR2, TLR4, IL1B, IL8, CD45, CD69 и снижением экспрессии генов CD68, IL18 и GATA3 по сравнению с группой здоровых небеременных пациенток. Среди беременных пациенток с Ureaplasma spp. (n=16) профиль экспрессии анализируемых генов не отличался от такого в группе здоровых беременных женщин за исключением IL15, его экспрессия была повышена в 3 раза.

Группа небеременных пациенток с облигатно-анаэробным дисбиозом (n=15) характеризовалась достоверным снижением уровней экспрессии генов CD68, IL18, GATA3 и IL12A (p<0,05) в сравнении с группой здоровых небеременных женщин.

Группа беременных женщин с обильными выделениями (n=8) не отличалось по количеству транскриптов анализируемых генов в клетках слизистой влагалища от такового в группе здоровых беременных, за исключением гена GATA3, экспрессия которого была повышена в 2 раза.

Следует отметить, что уровень экспрессии генов IL6, LIF, TLR9, GNLY, IL2RA, IL15, TBX21, RORC, FOXP3 и IFNG в клетках слизистой влагалища невысок. Область линейного диапазона для анализируемых генов соответствует концентрациям от 600 до 108 копий мРНК на на образец. Количество копий мРНК генов, преведенных выше, в большей части клинических образцов выходила за нижние границы линейного диапазона (600 копий мРНК/образец). Кроме того экспрессия этих генов детектировалась не во всех образцах, поэтому данные маркеры нецелесообразно использовать для диагностики воспалительных состояний.



Pages:     | 1 || 3 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.