WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 | 2 ||

Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах

-- [ Страница 3 ] --

Поскольку экспрессия референсных генов (TBP, B2M, GUS) может изменяться при некоторых обстоятельствах, а нормировка по группе из нескольких таких генов достаточно трудоемка, поиск генов, соотношение экспрессии которых может служить самостоятельным индексом (маркером) того или иного состояния, представляет большой интерес для использования в диагностических целях. В этом случае соотношение экспрессии вычисляется по формуле:

[Ген1]/[ Ген2] = E2Cp2/E1Cp1,

где Сp1 и Сp2- значения характеристических циклов ПЦР, а Е1 и Е2 –эффективности амплификации соответствующих генов.

В случае исследования групп женщин с вагинитами в качестве такого индекса могут служить соотношения экспрессии генов IL1B/CD68, IL10/IL18 и TLR4/GATA3 (рис.1).

 Соотношения значений индексов в контрольной группе небеременных-0

Рисунок 1. Соотношения значений индексов в контрольной группе небеременных женщин и группе небеременных женщин с вагинитами, нормированные на Ме группы здоровых небеременных женщин (за 1 приняты значения Ме в группе здоровых небеременных женщин (*p<0,05)).

Наличие статистически значимых различий в профиле экспресси этих генов легло в основу создания модели, позволяющей объективно оценить наличие локальной воспалительной реакции.

Для построения классификационной модели, позволяющей разделять группы здоровых женщин и пациенток с вагинитами, а также ее проверки, для небеременных женщин репродуктивного возраста было проанализировано две выборки: обучающая (n=78) и проверочная (n=77). Обе выборки включали по 2 группы: группу здоровых женщин и группу женщин с вагинитами. Деление на группы осуществляли случайным образом.

В результате проведения многофакторного анализа была подобрана каноническая линейная дискриминантная функции (КЛДФ), уравнение которой имело вид:

,

где [IL1B], [CD68], [IL10], [IL18], [TLR4] и [GATA3] – значения экспрессии данных генов (значения Ср) для конкретного образца.

Данная функция позволила классифицировать пациенток репродуктивного возраста по наличию воспалительной реакции во влагалище. В результате классификации 95% (19 из 20) здоровых небеременных женщин и 93% (54 из 58) пациенток с вагинитами были классифицированы верно (рис. 2).

 Распределение групп здоровых небеременных женщин и женщин с-2
Рисунок 2. Распределение групп здоровых небеременных женщин и женщин с вагинитами в зависимости от значений КЛДФ для обучающей выборки.

При проверке подобранной функции на тестовой выборке (n=77) анализ данных показал, что 95% женщин были классифицированы верно.

Для оценки диагностических возможностей предложенной модели с использованием КЛДФ был выполнен ROC-анализ. Площадь под ROC-кривой составила 0,98 (p<0,05). Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как «отличную».

В качестве точки cut off было выбрано значение, равное -0,61, соответствующее максимальной сумме чувствительности и специфичности. Чувствительность и специфичность предложенной модели по разделению здоровых женщин и пациенток с вагинитом в области порогового значения составила 96% и 95% соответственно. Значения показателей КЛДФ выше cut off классифицировались как признак локальной воспалительной реакции слизистой влагалища (рис.3).

По результатам классификации с использованием предложенной модели пациентки дополнительных групп сравнения были разделены следующим образом: 86% пациенток с кандидоносительством, 40% женщин с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл и 47% пациенток с облигатно-анаэробным дисбиозом были классифицированы как здоровые женщины (рис. 3).

 Распределение групп небеременных женщин репродуктивного-3
Рисунок 3. Распределение групп небеременных женщин репродуктивного возраста в зависимости от значений КЛДФ.

В ходе выполнения работы были выявлены общие тенденции в изменении эксперессии генов иммунного ответа при вагинитах как среди небеременных женщин, так и среди беременных пациенток. Данный факт послужил основанием использовать подобранные ранее маркерные индексы (IL1B/CD68, IL10/IL18 и TLR4/GATA3) для разделения групп условно здоровых беременных женщин и женщин с воспалением. Следует отметить, что уровень экспрессии потенциальных генов-маркеров локального воспаления (IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFA, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1) в контрольных группах небеременных и беременных женщин отличается: среди беременных пациенток контрольной группы достоверно повышена экспрессия генов IL10, IL12A, TGFB1 и CD68 и снижена – IL18, TNFA, CD45 (p<0.05) по сравнению с контрольной группой небеременных женщин репродуктивного возраста (рис. 4), что, вероятно, связано с разным физиологическим состоянием (беременность).

 Уровни экспрессии генов иммунного ответа в вагинальных мазках-4
Рисунок 4. Уровни экспрессии генов иммунного ответа в вагинальных мазках здоровых беременных и здоровых небеременных женщин, нормированные на Ме группы здоровых небеременных женщин. За 1 приняты значения Ме в группе здоровых небеременных женщин (*p<0,05)




В связи с разным уровнем экспрессии генов в группах здоровых беременных и небеременных женщин для группы беременных пациенток были определены другие коэффициенты в уравнении КЛДФ:

,

где [IL1B], [CD68], [IL10], [IL18], [TLR4] и [GATA3] – значения экспрессии данных генов (значения Ср) для конкретного образца.

В результате классификации 95% (38 из 40) здоровых беременных женщин и 96% (23 из 24) пациенток с вагинитами были классифицированы верно.

По результатам ROC-анализа площадь под ROC-кривой составила 0,993 (p<0,05). Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как «отличную». Значение точки cut off составило 0,65. Чувствительность и специфичность предложенной модели составила 96% и 95% соответственно. Значения показателей функции выше cut off классифицировались как признак локальной воспалительной реакции слизистой влагалища.

По результатам классификации с использованием предложенной модели беременные пациентки дополнительных групп сравнения были разделены следующим образом: 82% женщин с кандидоносительством, 75% женщин с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл, а также все пациентки с обильными выделениями были классифицированы как здоровые (рис. 5).

 Распределение групп беременных женщин в зависимости от значений-6
Рисунок 5. Распределение групп беременных женщин в зависимости от значений КЛДФ.

Анализ течения родов показал, что осложнения родов и послеродового периода статистически значимо чаще встречались в группе беременных с признаками воспаления слизистой влагалища (p=1,3*10-5, OR=10,4 (3,28-32,94)). Таким образом, помимо качественного и количественного состава микробиоты влагалища существенным фактором риска послеродовых осложнений является наличие локальной воспалительной реакции слизистой влагалища.

В результате проведенных исследований был предложен новый метод объективной оценки локального воспалительного процесса для беременных и небеременных женщин на основании определения количества транскриптов генов иммунного ответа, что может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия, позволяющего объективно различить бессимптомное носительство условно-патогенных микроорганизмов от проявлений вагинита.

С развитием молекулярно-генетических методов, в частности количественной ОТ-ПЦР, появилась возможность оценки профиля активности различных генов в широком спектре биологического материала. Лабораторная оценка профиля экспрессии генов иммунного ответа во влагалище на базе стандартной ПЦР лаборатории позволяет существенно повысить объективность диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний и может быть использована для своевременной профилактики осложнений родов и послеродового периода.

ВЫВОДЫ

  1. Получены новые научные данные, конкретизирующие предстравления о молекулярно-генетических особенностях местного иммунитета и его роли в иммунологии реподукции.
  2. Впервые проведено систематическое исследование профиля экспрессии широкого спектра генов иммунного ответа (24 гена) и выявлена ассоциация экспрессии 14 из них (IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFА, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC) с проявлением местного воспаления.
  3. Воспалительные состояния влагалища беременных и небеременных женщин сопровождаются изменением уровня транскриптов генов иммунного ответа (экспрессия генов IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFА повышается, а GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC снижается), что позволяет использовать данные маркеры для оценки воспалительного процесса.
  4. Установлено повышение экспрессии генов IL10, IL12A, TGFB1, CD68 и снижение – IL18, TNFA, CD45 в клетках слизистой влагалища здоровых беременных женщин в сравнении со здоровыми небеременными женщинами.
  5. На фоне локального изменения экспрессии генов IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFА, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC в предродовом периоде установлено статистически значимое повышение частоты осложнения родов (преждевременное излитие околоплодных вод, разрыв мягких тканей родовых путей) и послеродового периода (раневая инфекция, послеродовой эндометрит) в группе беременных женщин с вагинитами.
  6. Оценка количества мРНК генов IL1B, IL18, IL10, CD68, TLR4 и GATA3 может служить основой для создания метода диагностики воспалительных состояний влагалища с чувствительностью и специфичностью в области порогового значения 96% и 95% соответственно как для беременных, так и для небеременных женщин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О. С., Трофимов Д.Ю., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Екимов А.Н. Состояние локального иммунитета при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Иммунология. - 2011. - №3. – С.154-163.
  2. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Донников А.Е. Цитокиновый профиль иммунокомпетентных клеток влагалища при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Уральский медицинский журнал. - 2011. - №3. - С.44-49.
  3. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Донников А.Е., Дуринян Э.Р., Бирюкова А.М. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов в вагинальных мазках женщин репродуктивного возраста при неспецифическом вагините и бактериальном вагинозе. // Акушерство и гинекология. - 2011. - №7-2. - С.33-38.
  4. Байрамова Г.Р., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Екимов А.Н. Состояние локального иммунитета при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Акушерство и гинекология. - 2011. - №1. - С.52-56.
  5. Меджидова М.К., Бурменская О.В., Донников А.Е., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Тютюнник В.Л., Сухих Г.Т. Оценка локальной воспалительной реакции во влагалище по профилю экспрессии мРНК генов цитокинов у беременных накануне родов. // Акушерство и гинекология. 2012. - №3. - С.26-31.
  6. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Муллабаева С.М., Екимов А.Н., Донников А.Е. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим рецидивирующим вульвовагинальным кандидозом. // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». - 28 сентября - 1 октября, Москва, 2010. - С.531-532.
  7. Байрамова Г.Р., Непша О.С., Бурменская О.В., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю. Локальная экспрессия мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим вульвовагинальным кандидозом. // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье. Сборник материалов III междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». - 3 июня, Санкт-Петербург, 2010. – С.15-16.


Pages:     | 1 | 2 ||
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.