WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Механизмы регуляции сократительной функции предсердий мыши при активации бета-2- адренорецепторов

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Одношивкина Юлия Геннадьевна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПРЕДСЕРДИЙ МЫШИ ПРИ АКТИВАЦИИ БЕТА-2- АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань-2013

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН

Зефиров Андрей Львович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Аникина Татьяна Андреевна

доктор медицинских наук, профессор Пятин Василий Федорович

Ведущая организация – Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН

Защита состоится «19» февраля 2013 г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.28 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» http://ksu.ru

Автореферат разослан «__»_______________2013 г

Ученый секретарь

диссертационного cовета

д.м.н., профессор Зефиров Т.Л.


Введение


Актуальность исследования

Исследование регуляции сократимости миокарда является актуальным направлением в физиологии сердца. Один из основных механизмов, контролирующих сердечную деятельность, связан с воздействием катехоламинов (адреналина и норадреналина) на -адренорецепторы кардиомиоцитов [Д.В. Aбрамочкин, Г.С. Сухова, Л.В. Розенштраух, 2006; Кошелев В.Б., 2010; Buxton B.F., et al., 1987]. На основании структурных особенностей и разной чувствительности к фармакологическим агентам адренорецепторы разделяют на 1, 2, и 1, 2, 3 подтипы. В сердце человека доминируют 1 и 2 подтипы, а их соотношение в предсердиях и желудочках составляет 70:30 % и 80:20 %, соответственно [Buxton B.F. et al., 1987].

Молекулярные исследования 2-адренорецепторов обнаружили их крайне интересные свойства. Активация 2-адренорецепторов кардиомиоцитов снижает негативные эффекты гипоксии, воспаления и активных форм кислорода [McGraw D.W., Liggett S.B., 2005]. Было показано существование нескольких активных состояний (конформаций) 2-адренорецептора, в которых рецептор с разной эффективностью связывается с сигнальными молекулами и, следовательно, способен запускать различные варианты клеточных ответов [Bokoch M. P., et al., 2010; Jozwiak K., et al., 2010; Rosenbaum D. M., et al., 2011]. При этом разные агонисты переводят 2-адренорецепторы в специфичные активные конформации, поэтому от типа агониста зависит клеточный ответ (этот феномен называют «функциональной селективностью» агонистов). Также в зависимости от дозы агониста 2-адренорецепторы могут «нанимать» для передачи сигнала внутрь клетки различные сигнальные каскады и/или с разной эффективностью связываться с эффекторными молекулами [Sun Y., et al., 2007]. Как и все адренорецепторы, 2-подтип принадлежит к суперсемейству сопряженных с G-белками рецепторов. При этом 2-адренорецепторы взаимодействуют с разными G-протеинами: Gs-белком, стимулирующим каскад аденилатциклаза – цАМФ - протеинкиназа А, и Gi-белком, который угнетает аденилатциклазу и активирует путь фосфоинозитол-3-киназа - протеинкиназа В [Swift S.M. et al., 2007; Liu R. Et al., 2009].

Механизмы действия 2-адренорецепторов малоизучены и затрагивают, по разным данным, систему аденилатциклазы, потенциал-зависимые Са-каналы L-типа, рианодиновые рецепторы и другие сигнальные молекулы [Cherezov V. et al., 2007; Haase H., 2007; Zhou P. еt al., 2009]. Таким образом, 2-адренергическая регуляция сердца остается недостаточно изученной, и ее детальное исследование может внести существенный вклад в разработку новых кардиопротекторных и кардиомодулирующих препаратов.

Цель и задачи исследования:

Целью исследования являлось выявление эффектов и механизмов действия агониста 2-адренорецепторов (фенотерола) на сократимость, Са2+-сигналы и продукцию оксида азота в изолированных предсердиях мыши.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вклад 2-адренорецепторов в реакцию предсердий на норадреналин.

2. Определить эффект разных доз агониста (фенотерола) на силу сокращения изолированных предсердий мыши.

3. Выявить влияние низких (5 мкМ) и высоких (50 мкМ) доз фенотерола на динамику Са2+ - сигналов и продукции оксида азота.

4. Выявить роль аденилатциклазы и протеинкиназы А в эффектах активации 2 – адренорецепторов.

5. Выявить роль NO-синтазы в эффектах активации 2– адренорецепторов.

6. Определить влияние длительности активации 2–адренорецепторов на силу сокращения изолированных предсердий мыши.



7. Исследовать изменение сократимости, Са2+-сигналов и продукции оксида азота при кратковременной активации 2– адренорецепторов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активация 2–адренорецепторов селективным агонистом (фенотеролом) увеличивает силу сокращения предсердий. Динамика положительной инотропной реакции определяется концентрацией и длительностью аппликации агониста.

2. Механизм эффектов активации 2 – адренорецепторов связан с изменением активности двух каскадов (аденилатциклазный и NO-синтазный), разнонаправлено регулирующих силу сокращения.

Научная новизна

В работе впервые произведен подробный анализ влияния разных доз агониста и отличающихся по длительности аппликаций на функционирование предсердий. Был выявлен медленно-развивающийся (через 15-20 мин после аппликации) положительный инотропный эффект агониста 2-адренорецепторов фенотерола, в концентрации 5 мкМ. Тогда как фенотерол в высокой концентрации (50 мкМ) вызывал быструю положительную инотропную реакцию предсердий. При этом оба эффекта исчезали на фоне селективного ингибирования 2-адренорецепторов и зависели от увеличения внутриклеточного систолического уровня Са2+ и изменения продукции оксида азота. В ходе выполнения исследования была предложена и подтверждена гипотеза о том, что фенотерол запускает внутриклеточные сигнальные каскады (аденилатциклаза - протеинкиназа А - Са-каналы L-типа и NO-синтаза), которые определяют специфику разносторонней регуляции силы сокращения. Также нами были получены приоритетные данные об увеличении амплитуды сокращений предсердий, проявляющемся только после завершения кратковременной фармакологической стимуляции 2-адренорецепторов. Этот эффект сопровождался увеличением внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и снижением продукции оксида азота.

Научно-практическая ценность

Полученные данные имеют теоретический характер, дополняя современные представления о механизмах регуляции деятельности сердца, и имеют прикладные аспекты, связанные с обоснованием применения агонистов 2-адренорецепторов при лечении сердечной недостаточности и с разработкой методов помпового (периодичного) введения 2-адреномиметиков, при которых агонист действует кратковременно. То есть имеют практическое значение при разработке средств фармакологической коррекции сердечной деятельности. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 12-04-31032-мол-а, 11-04-00422-а).

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и съездах: на XV, XVI, и XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010, 2011, 2012); международном симпозиуме «Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Пущино, 2010), XXІ съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносова» (Москва, 2011); второй конференции молодых ученых и студентов "Экспериментальная и прикладная физиология" (Москва, 2011), V всероссийской с международным участием школе-конференции «Физиология кровообращения» (Москва, 2012), на заседании ФО им. И.П. Павлова (Казань, 2012), на заседании кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета (2012).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном медицинском университете. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация объемом 120 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 256 источников, из них 11 - отечественных и 245 - иностранных авторов. Диссертация содержит 20 рисунков и 1 таблицу.

Объект и методы исследования

Эксперименты проводились на препаратах изолированных предсердий белых мышей. Все эксперименты выполнены при постоянной наружной перфузии препарата раствором Кребса для теплокровных животных следующего состава (мМоль/л): NaCl —.144,0; KCl — 5,0; MgCl2 – 1,0; CaCl2 – 2,0; NaH2PO4 — 1,0; NaHCO3 —2,4; C6H12O6 — 11,0. Все эксперименты проведены при температуре 20оС, рН поддерживался на постоянном уровне 7.2-7.4.

В экспериментах применяли следующие фармакологические препараты:(±)-фенотерол - селективный агонист 2 – адренорецепторов, в концентрациях 1-300 мкМ ; ICI-118.551- селективный блокатор 2 –адренорецепторов, в концентрации 0,1 мкМ; Rp-Adenosine 3,5-cyclic monophosphorothioatetriethyl ammonium salthydrate (Rp-cAMPS) -блокатор протеинкиназы А, в концентрациях 5 и 20 мкМ; N-Nitro-L-arginine methylesterhydrochloride (L-NAME) -блокатор NO-синтазы, в концентрации 100 мкМ; cisN-(2-phenylcyclopentyl) azacyclotridecl-en-amine hydrochloride (MDL-12330А) -ингибитор аденилатциклазы, в концентрациях 3-20 мкМ; Все использованные вещества фирмы «SIGMA» (США).





Тензометрия. Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro у мыши изучали на изолированных предсердиях. Эксперименты по определению сократимости миокарда проводились на установке PowerLab (AD Instruments, Австралия), датчиком силы МLТ 050/D (AD Instruments, Австралия). Препарат помещали вертикально в резервуар объемом 20 мл, рабочий раствор при комнатной температуре. Верхний конец препарата прикреплялся к датчику напряжения через металлическую планку, нижний конец к фиксирующему блоку. Препарат стимулировался электрическим стимулом через 2 платиновых электрода (с помощью стимулятора ЭСЛ–2 (Россия) с частотой стимулов 0,1 Гц амплитудой сигнала 40 мВ, продолжительность стимула 5 мс. Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.3". Сигналы обрабатывали с помощью программы Chart или Elf (автор А.В.Захаров), силу сокращения определяли в граммах. Оценивали силу сокращения. Статистический анализ проводили с помощью стандартных методов, достоверность различий определяли с помощью параметрического t-критерия Стьюдента (Лакин, 1984).

Флуоресцентная микроскопия. Флуоресценцию наблюдали с помощью микроскопов OLYMPUS cX41 (со сменными монохроматическими источниками возбуждающего света) и OLYMPUS BX51 (оснащенного конфокальной системой DSu) с использованием объективов LMPlanFI 20/0.40 и uPlanSApo 60/1.20W. Изображения регистрировали быстродействующими ССD-видеокамерами фирмы OLYMPUS, черно-белой F-View II и цветной DP71. Для обработки изображений применяли программы Сell^A, cell^P и ImagePro. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах (отн.ед.), соответствующих значению яркости в пикселях.

Измерение внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Изменения концентрации Са2+ определяли с помощью красителя Fluo-4, который позволяет точно измерять концентрации Са2+ в диапазоне от 1 мкМ до 1 мМ. Fluo-4 слабо флуоресцирует в отсутствие Са2+, однако при связывании с ионами Са2+ флуоресценция Fluo-4 увеличивается более чем в 100 раз [Harkins A.B.,etal., 1993]. Препарат изолированного предсердия выдерживали в растворе, содержащем 1 мкМ Fluo-4-AM, в течение 20 мин при комнатной температуре, и перфузировали физиологическим раствором, не содержащим краситель, в течение 30 мин. Далее регистрировали флуоресценцию в пучке кардиомиоцитов. Флуоресценцию красителя возбуждали короткими (около 1 с) вспышками света с длиной волны 480 нм, а свечение регистрировали с использованием эмиссионного светофильтра, пропускающего свет с длиной волны более 515 нм. В ходе циклов сокращения–расслабления препарата наблюдались периодические изменения свечения Са2+-сенсора в виде вспышек («Са2+ - сигналов»). Для оценки амплитуды Са2+ - сигналов из значения максимальной флуоресценции (в период систолы) вычитали минимальную величину флуоресценции в период диастолы.

Измерение концентрации оксида азота (NO). Продукцию оксида азота детектировали при помощи маркера DAF-FM-диацетата (Molecular Probes, США), который возбуждали светом длиной волны = 495 нм, а при регистрации флуоресценции применяли эмиссионный фильтр, пропускающий свет с длиной волны более 515 нм. DAF-FM практически не флуоресцирует до вступления в реакцию с NO, но при взаимодействии с NO его флуоресценция возрастает более чем в 160 раз [Woo A.Y.,et al.,2009]. DAF-FM растворяли в DMSO и хранили в замороженном виде в защищенном от света месте. Препарат изолированного предсердия выдерживали в растворе с 2 мкМ DAF-FM-диацетатом в течение 30 мин. Далее препарат перфузировали физиологическим раствором, не содержащим краситель, в течение 20 мин (время, за которое заканчивается реакция деацетилирования маркера) [Kojima H., etal., 1999], после чего регистрировали флуоресценцию в пучке кардиомиоцитов. Статистический анализ проводили при помощи программы OriginPro. Результаты измерений представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (n – число независимых опытов). Достоверность различий определяли с помощью критериев Стьюдента и ANOVA.

Эксперименты выполнены совместно с А.М. Петровым (доц. каф. норм. физиологии КГМУ, к.б.н.)

Результаты исследования и их обсуждение



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.