WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Физиологические факторы, определяющие изменения сократительных свойств одиночных мышечных волокон при гравитационной разгрузке

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ПОНОМАРЕВА Елена Владимировна

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ ОДИНОЧНЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН ПРИ ГРАВИТАЦИОННОЙ РАЗГРУЗКЕ

03.03.01 – физиология

03.01.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор биологических наук, профессор Шенкман Борис Стивович

Доктор физико-математических наук Цатурян Андрей Кимович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук Фомина Елена Валентиновна

Доктор биологических наук, профессор Архипенко Юрий Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», биолого-почвенный факультет.

Защита диссертации состоится « 24 » февраля 2011 г. в 1130 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д.76-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения РАН ГНЦ РФ – Института медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан « 20 » января 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что продолжительная невесомость сопровождается снижением тонуса, уменьшением силы и выносливости скелетных мышц человека (Григорьев А.И. и др., 2002; Fitts R.H. et. al., 2010). На уровне одиночного мышечного волокна гравитационная разгрузка также сопровождается атрофическими изменениями – уменьшением объема миофибриллярного аппарата и снижением основных сократительных характеристик. Важным параметром, описывающим сократительные способности мышечного волокна, является кальциевая чувствительность, которая характеризуется зависимостью развиваемой силы от концентрации ионов Са2+ в миоплазме, т.н. кривой «кальций-сила». Сдвиг этой кривой вправо свидетельствует о снижении кальциевой чувствительности. Кальциевую чувствительность характеризуют величиной рСа50 (здесь рСа = lg[Ca2+]), которая является отрицательным логарифмом концентрации кальция, при которой сила, развиваемая мышечным волокном, составляет половину максимальной. Уменьшение рСа50 наблюдают у животных и у человека в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки (Stevens L. et. al., 1993).

Основными причинами снижения сократительных свойств одиночных мышечных волокон при гравитационной разгрузке являются отсутствие напряжения, в связи с устранением силы тяжести, и уменьшение нейромышечной активности. Сопутствующим условием невесомости является устранение опоры, которое приводит к уменьшению активности опорного афферентного входа и сопровождается снижением тонической мышечной активности (Григорьев А.И. и др. 2004). Другие факторы, сопутствующие функциональной разгрузке, такие как деградация цитоскелетных белков, накопление ионов кальция и сдвиг экспрессии тяжелых цепей миозина в сторону быстрых изоформ, также влияют на снижение сократительных параметров волокон скелетных мышц млекопитающих.

Исследования в данной области ведутся достаточно давно, однако до сих пор неясно, какой из вышеперечисленных процессов является первичным в запуске гипогравитационного синдрома.

Цель работы. Исследование сократительных свойств одиночных волокон скелетных мышц человека и животных в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки и анализ возможных механизмов их изменения.

Задачи исследования:

  1. Проанализировать сократительные параметры волокон скелетных мышц крыс после трехсуточной моделируемой микрогравитации.
  2. Сравнить изменения сократительных характеристик одиночных волокон постуральных и локомоторных мышц крыс после кратковременной гравитационной разгрузки.
  3. Сравнить характер и степень изменений основных сократительных параметров одиночных мышечных волокон монгольских песчанок и крыс после космического полета одинаковой продолжительности.
  4. Оценить, каким образом применение блокатора медленных кальциевых каналов L-типа отражается на сократительных параметрах волокон скелетных мышц крыс после моделируемой гравитационной разгрузки.
  5. Исследовать роль опорного стимула и вызванного мышечного напряжения в качестве мер предотвращения снижения сократительных свойств волокон m. soleus человека после 7 суточной «сухой» иммерсии.

Научная новизна работы:

- впервые показано, что кратковременная трехдневная моделируемая гравитационная разгрузка приводит к снижению изометрической силы сокращения одиночных скинированных волокон m. soleus крыс.

- впервые установлено, что при трехсуточном антиортостатическом вывешивании крыс основные сократительные параметры волокон быстрых мышц (m. gastrocnemius, m. tibialis anterior) остаются без изменений.

- впервые показано, что после 7 суток антиортостатического вывешивания крыс снижаются основные сократительные параметры одиночных волокон быстрых m. gastrocnemius и m. tibialis anterior.



- впервые обнаружено, что после двенадцатисуточного космического полета монгольских песчанок наблюдается уменьшение диаметра и максимальной силы сокращения волокон камбаловидной мышцы.

- впервые установлено, что трехсуточное антиортостатическое вывешивание крыс с одновременным пероральным приемом нифедипина препятствует снижению максимальной изометрической силы сокращения волокон камбаловидной мышцы.

- впервые показано, что электромиостимуляция мышц голени человека во время семисуточной «сухой» иммерсии не предотвращает снижения максимальной и удельной силы сокращения одиночных волокон m. soleus.

Научная и практическая значимость

Работа в значительной мере расширяет наши представление об изменениях сократительных параметров одиночных мышечных волокон млекопитающих после гравитационной разгрузки. Представленные результаты позволяют предположить, что ключевую роль в снижении сократительных параметров мышечных волокон играют потеря напряжения и активности на разных сроках гравитационной разгрузки. Методы тензометрических измерений сократительных свойств мышечных волокон и результаты данной работы успешно используются в процессе обучения аспирантов Института медико-биологических проблем РАН и студентов-практикантов Московского физико-технического института (ГУ).

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Снижение сократительных параметров одиночных волокон постуральных мышц начинаются уже на третьи сутки моделируемой гравитационной разгрузки.
  2. На раннем этапе гравитационной разгрузки у человека и животных изменения сократительных характеристик одиночных волокон определяются в первую очередь снижением нейромышечной активности.
  3. Характер изменений сократительных свойств одиночных волокон в условиях микрогравитации имеет видовые отличия и зависит от функциональных особенностей мышц.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 21 публикациях в научных журналах и сборниках конференций, из них 5 в ведущих российских и международных рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК.

Апробация работы. Основные результаты были доложены на XXXVII Европейской мышечной конференции (Оксфорд, Великобритания, 2008); на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: новые методы исследования» (Пущино, 2010); на XXXI Международном гравитационном симпозиуме (Триест, Италия, 2010); на VII, IX «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной дню космонавтики (Москва, 2008, 2010); на V Международной конференции по физиологии мышечной деятельности (Москва, 2009).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол № 7 от 02.11.2010 г.).

Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований ГНЦ РФ – ИМБП РАН, программ отделения биологических наук РАН, грантов РФФИ: 07-04-00763а, 07-04-12153-офи, 10-04-00106-а.

Структура диссертации. Работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждение, а также выводы. Диссертационная работа изложена на 107 страницах, содержит 22 рисунка, 6 таблиц и список цитируемой литературы из 132 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный материал. Основную часть данной работы составлял тензометрический анализ сократительных параметров одиночных волокон скелетных мышц млекопитающих. Эксперименты проводили с участием человека, а также с использованием экспериментальных животных: крыс породы Wistar (в возрасте 2 месяца, средней массой 190-220 г.) и монгольских песчанок (в возрасте 2 месяца, средней массой 55-60 г), выращенных в виварии Учреждения РАН ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Для человека применяли модель семисуточной «сухой» иммерсии (Шульженко Е.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976). Все испытуемые были добровольцами и официально дали согласие на участие в исследованиях в соответствии с нормами Хельсинской Декларацией. Условия микрогравитации для крыс воспроизводили с помощью модели антиортостатического вывешивания (Ильин Е.А., Новиков В.Е., 1980; Wronski T.J., Morey-Holton E.R., 1987). Все экспериментальные процедуры были одобрены Комиссией по биомедицинской этике Учреждения РАН ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Забор мышечной пробы из m. soleus человека производили методом игольчатой биопсии по Бергстрему. У крыс и монгольских песчанок, умерщвленных овер-дозой пентобарбитала натрия или декапитацией, m. soleus, m. tibialis anterior и m.gastrocnemius выделяли целиком. Мышечные пробы обрабатывали по стандартной методике химического скинирования, то есть частичного разрушения клеточной мембраны. Согласно этому протоколу, подробно изложенному в работах группы Mounier (Mounier Y. et. al., 1989), образцы мышечной ткани помещали в скинирующий раствор, содержащий ЭГТА, непосредственно после выделения. После 24 часов обработки в скинирующем растворе мышечные пробы помещали в раствор для хранения, содержащий в равных долях скинирующий раствор и глицерин. Во всех растворах, использованных для отмывки мышечных проб, содержалось 2,5 мМ АТФ, для предотвращения образования состояния ригора. Экспериментальный материал использовали не ранее, чем через неделю, но не позднее 2 месяцев со дня помещения в раствор для хранения.





Мышечные волокна выделяли из проб мышечной ткани с использованием микрохирургических инструментов. Из одной пробы получали в среднем 7 волокон. Сегмент волокна длиной 1-2 мм помещали в кювету с расслабляющим раствором R. Один конец волокна крепили к датчику силы (модель FORT 10, World Precision Instruments, США, чувствительность 1 В/мН, уровень шума <3 мкН), а другой – к неподвижному рычагу.

Механическое сокращение одиночного мышечного волокна регистрировали 2-канальным высокочастотным аналого-цифровым преобразователем, который был специально разработан Д.Д. Мациевским (Институт общей патологии и патофизиологии РАМН). Силу сокращения измеряли при 8 значениях концентраций ионов кальция, длительность записи сокращения для каждой концентрации составляла, в среднем, 1,5 минуты. Для регистрации сигналов датчика силы в нашем институте была разработана программа управления экспериментом и сбора данных в память персонального компьютера (Литвинова К.С., 2005). Для анализа эксперимента использовали программный пакет, созданный на базе программы Лилльского технологического университета (Франция) в модификации ИМБП РАН, которая работала в среде Microsoft Excel. У каждого исследуемого волокна измеряли длину саркомеров по дифракции света гелий-неонового лазера (длина волны 633 нм, мощность 4 мВт). Под контролем дифракции устанавливали длину саркомеров 2,6 ± 0,1 мкм для волокон из мышц крыс и песчанок и 2,4 ± 0,1 мкм для волокон из мышц человека, что позволяло стандартизировать данные при измерении максимальной силы (Р0). Диаметр волокна измеряли с помощью бинокулярного микроскопа (80) по микрометрической шкале, расположенной в окуляре (1 деление = 20 мкм).

В начале эксперимента для каждого волокна прописывали нулевое значение силы в расслабляющем растворе, а затем максимальное изометрическое напряжение P0 при насыщающей концентрации Ca2+, соответствующей рСа = 4,2. После этого волокно расслабляли в растворе R в течение 3 минут, а затем регистрировали силу сокращения в каждом из 8-ми растворов с различными концентрациями Ca2+, начиная от минимальных значений к максимальным.

Рассчитывали взаимосвязь сила – концентрация Ca2+. Каждая амплитуда силы сокращения, полученная для соответствующих растворов с различными концентрациями Ca2+, была нормализована на величину максимальной силы Р0. Экспериментальные результаты обрабатывали с использованием уравнения Хилла:

P/P0 = ([Ca2+]/Kd)N / 1+([Ca2+]/Kd)N, где N – коэффициент Хилла, характеризующий крутизну зависимости P/P0 от рСа; Са2+ – данная концентрация ионов кальция, а Кd – постоянная Хилла (рКd= logKd=pCa50); Р сила, с которой сокращается волокно при данной концентрации Са2+; Р0 сила максимального сокращения волокна в растворе с насыщающей концентрацией Са2+. Здесь pCa50 – это значение рСа, при котором развиваемая сила равна половине ее максимального значения. На основании полученных данных определяли удельную силу сокращения Pуд, которую рассчитывали как отношение максимальной изометрической силы сокращения к площади поперечного сечения волокна: Руд= Р0 10-4/R2, где R=D/2.

Растворы. Концентрацию компонентов во всех растворах рассчитывали по методике Fabiato A. (Fabiato A., 1974), конечная ионная сила растворов составляла 200 мМ, а рН 7,00. Скинирующий раствор содержал (в мМ): 20 MOPS, 2,5 Mg ацетат и 5 K2-EGTA, 170 пропионат калия. Расслабляющий раствор R был такой же по составу, как и скинирующий. Активирующие растворы были приготовлены на основе расслабляющего раствора, содержавшего различные концентрации Са2+ (свободные ионы поступали из CaCO3). Во все экспериментальные растворы непосредственно перед их применением добавляли 2,5 мМ АТФ.

Статистическую обработку проводили на персональном компьютере с использованием стандартной программы Microsoft Excel 2007®. Различие средних значений показателя в сравниваемых выборках считали значимым при уровне р <0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения сократительных параметров одиночных волокон m. soleus, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius после 3-х и 7-ми суточного антиортостатического вывешивания крыс

Как известно, в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки наблюдается снижение сократительных параметров волокон скелетных мышц млекопитающих. Однако в литературе речь идет, как правило, о длительном воздействии невесомости. Нами было сделано предположение, что снижение сократительных свойств мышечных волокон начинается уже с самых ранних этапов гравитационной разгрузки. Для проверки данного предположения было проведено антиортостатическое вывешивание крыс сроками 3 и 7 суток. Исследование сократительных параметров проводили на одиночных волокнах медленного экстензора m. soleus, быстрого флексора m. tibialis anterior и быстрого экстензора m. gastrocnemius. Животные были разделены на 3 группы по 7 особей в каждой: «контроль», «3HS» и «7HS». Во всех экспериментальных группах крысы получали комбинированный корм в соответствии с кормом для лабораторных животных и воду ad libitum. В группе «контроль» крысы находились в стандартных условиях вивария. В экспериментальных группах «3HS» и «7HS» крысы находились в положении антиортостатического вывешивания в течение 3 и 7 суток, соответственно.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.