WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Экспрессия регуляторных генов fgf2, pax6, six3, otx2, pitx1 и pitx2 в эпиморфной регенерации сетчатки глаза у тритона pleurodeles waltl.

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АВДОНИН ПЕТР ПАВЛОВИЧ

Экспрессия регуляторных генов
Fgf2, Pax6, Six3, Otx2, Pitx1 и Pitx2 в эпиморфной регенерации
сетчатки глаза у тритона Pleurodeles waltl.

03.03.05 – биология развития, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Григорян Элеонора Норайровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Онищенко Галина Евгеньевна

доктор биологических наук Глазков Михаил Васильевич

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра эмбриологии

Защита диссертации состоится «20» октября 2010г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26).

Сайт: http://idbras.comcor.ru/indexr.htm.

e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан «20» сентября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ele0806@mail.ru Е.Б. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярно-генетических механизмов регенерации тканей глаза является одной из фундаментальных задач биологии развития и медицины. У большинства позвоночных животных и человека регенерация сетчатки возможна лишь на ранних этапах эмбриогенеза. Некоторые низшие позвоночные – рыбы и тритоны, напротив, сохраняют способность к полному восстановлению сетчатки на протяжении всей жизни. Исследование молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе регенерации сетчатки у тритона, может дать ответ на вопрос о причине утраты высшими позвоночными и человеком этой способности. Информация о молекулярных механизмах регенерации сетчатки может быть использована в практических целях для восстановления сетчатки после повреждений.

Одним из путей исследований молекулярных механизмов регенерации сетчатки тритона является поиск и анализ экспрессии регуляторных генов, которые могут запускать и контролировать клеточные процессы, приводящие к её восстановлению. Регенерация сетчатки у взрослых тритонов происходит в результате трансдифференцировки клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ). После удаления сетчатки, клетки РПЭ дедифференцируются, пролиферируют и формируют популяцию нейробластов, которые впоследствии дают начало всем типам клеток регенерирующей сетчатки.

Показано, что в основе регенерации сетчатки глаза тритона лежат процессы клеточной пролиферации и дифференцировки, сходные с таковыми в ходе развития глаза. Это послужило основанием для предположения о сходстве набора генов, осуществляющих контроль в регенерации и развитии сетчатки.

В эмбриогенезе позвоночных ключевую роль в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток сетчатки играют гены Fgf2, Pax6, Six3, Rx, Chx10, тогда как дифференцировка клеток РПЭ контролируется регуляторными генами Mitf, Otx2 и генами суперсемейства Tgf (Martinez-Morales et al., 2004; Zuber, Harris, 2006; Sigulinsky et al., 2008; Ohsawa, Kageyama, 2008). В контроль развития и дифференцировки сетчатки и РПЭ позвоночных могут быть также вовлечены регуляторные гены семейства Pitx (Chang et al., 2001; Evans, Gage, 2005; Маркитантова и др., 2006, 2008). В предшествующих исследованиях была показана экспрессия регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Chx10 и Otx2 в интактных тканях глаза тритонов и при регенерации сетчатки (Chiba, Mitashov, 2008). Тем не менее, данные об экспрессии регуляторных генов в регенерации сетчатки тритона, приводимые в современной литературе, немногочисленны и имеют разрозненный характер.

По этой причине несомненный интерес представляет детальное сравнительное исследование экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx и генов семейства Pitx на хорошо разработанной модели регенерации сетчатки тритона Pleurodeles waltl.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в исследовании молекулярно-генетических механизмов регуляции регенерации сетчатки тритона Pleurodeles waltl.

Были поставлены следующие задачи:

  1. Создать библиотеки кДНК, комплементарные мРНК из интактных тканей глаза и тканей глаза на последовательных стадиях регенерации сетчатки тритона P. waltl.
  2. Идентифицировать в геноме тритона P. waltl регуляторные гены Fgf2 и Pitx1.
  3. Провести сравнительный анализ экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx, Pitx1 в интактных тканях глаза и тканях глаза на последовательных стадиях регенерации сетчатки тритона P. waltl методами ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени.
  4. Провести сравнительный анализ локализации белков Fgf2, Pax6, Otx2, Pitx2 в интактных тканях глаза тритона P. waltl и при регенерации сетчатки методами иммунохимии.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено сравнительное исследование экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Six3, Otx2, Pitx1, Pitx2 и локализации белков Fgf2, Pax6, Otx2 и Pitx2 на последовательных стадиях регенерации сетчатки взрослого тритона. Проведён подробный количественный анализ экспрессии генов Fgf2, Pax6, Otx2 на последовательных стадиях трансдифференцировки клеток РПЭ. Выявлены закономерности в изменениях уровня экспрессии регуляторных генов Fgf2, Pax6, Otx2 в процессе трансдифференцировки. Высказано предположение о взаимодействиях исследуемых генов в регуляции процессов, приводящих к восстановлению сетчатки. Настоящая работа является фундаментальным исследованием, результаты которого вносят вклад в создание полной картины экспрессии генов в процессе трансдифференцировки клеток РПЭ и последующей регенерации сетчатки.



Используемые в работе стратегия и методы могут быть применены при разработке способов индукции регенерационных ответов клеток в поврежденной сетчатке высших позвоночных и человека. Результаты работы могут быть также использованы при разработке курса лекций по биологии развития и клеточной биологии.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на V Международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2008), конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Москва, 2007, 2008), Европейской конференции по регенерации «Молекулярные и клеточные основы регенерации и восстановления тканей» (Palma de Mallorca, 2008), XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009), III Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Из них 3 статьи в отечественных журналах, рекомендованных Перечнем ВАК, 3 статьи в научных сборниках и 5 тезисов международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на __175 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы. Иллюстративный материал содержит 28__ рисунков, _4___ таблиц. Список литературы включает _317 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Объектом исследования служили взрослые тритоны Pleurodeles waltl в возрасте 9-ти месяцев (в количестве 200 животных), разводимые в аквариальной ИБР РАН. Образцы интактных и регенерирующих тканей глаза получали от наркотизированных в растворе MS-222 (1:1000) животных и проводили микрохирургическое выделение тканей изолированных интактных глаз, а также операции по удалению сетчатки через разрез в дорсальной области глаза по методу Стоуна (Stone, 1950). В работе выделялись образцы следующих тканей глаза: интактная сетчатка, интактный РПЭ, РПЭ на 8 и 14 сут после удаления сетчатки, суммарный образец регенерата сетчатки и РПЭ на 20 сут после удаления сетчатки, РПЭ и регенерат сетчатки на 50 сут после операции. Отметим, что во всех случаях РПЭ было возможно выделить только вместе с сосудистой оболочкой.

Фиксация тканей и приготовление криосрезов. Для иммуногистохимического анализа целые глаза в течение 4 ч фиксировали в 4% параформальдегиде на 0.1 М PBS (рH 7.4). Затем глаза отмывали в том же буфере и проводили по растворам сахарозы восходящей концентрации (5%, 10%, 20%). В 20% растворе образцы оставляли на ночь при 4°C. Из замороженных при -70С в смеси Tissue-Tec ОСТ (Leica, Германия) и 20% сахарозы на 0.1 М PBS (1:1) глаз получали поперечные срезы 10 мкм с помощью криостата. Для морфологических исследований (контроль стадии регенерации) использовали окрашенные гематоксилин-эозином срезы, приготовленные методами рутинной гистологии.

Иммунохимические методы.

Иммуногистохимия. В работе использовали коммерческие антитела к Fgf2 (Sigma, США, 1:30), Pitx2 (Sigma, США, 1:400), Pax6 (Abcam, Великобритания, 1:200), Otx2 (Abcam, Великобритания, 1:500). Криосрезы обрабатывали по стандартной методике. Вторые антитела были конъюгированы с флуорохромами - Aleksa 488 (Green) и Aleksa 546 (Red), (Molecular Probs, США, 1:1000). После реакции со вторыми антителами, срезы вновь отмывали и заключали в среду Vectashield (Vector, США). Ядра окрашивали Hoechst 33342. Окрашивание анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM RXA2 (Германия), оснащенного компьютерной приставкой и программой Leica for Windows. Изображения анализировали с помощью компьютерной программы Image J.

Вестерн-блот гибридизация. Для получения ядерных экстрактов препарированные ткани глаза лизировали в буфере RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay buffer), содержащем: 150 мM хлорид натрия, 1% Тритон X-100, 0.5 % дезоксихолат натрия, 0.1 % SDS, 50мМ Трис, pH 8.0, 1мМ PMSF. Белок осаждали 10% ТХУ, количество белка в пробах определяли с помощью набора BSA (Pierce, США). После электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher and Schuell, Германия) с использованием камеры Xcell II (Invitrogen, США). Иммунохимическую реакцию проводили с первыми антителами к Pitx2 (1:750), Pax6 (1:750), Otx2 (1:500), и со вторыми антителами против иммуноглобулинов кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Cell Signaling Technology, США, 1:1000). Результат иммунохимической реакции визуализировали с помощью ECL–системы (Amersham Pharmacia Biotech, США).





Молекулярно-генетические методы.

Тотальную РНК из тканей глаза выделяли с помощью реактива TRI® Reagent (Sigma, США). Образцы тотальной РНК, выделенные из пигментированных тканей, очищали от примесей меланина по протоколу, предложенному Лагонигро (Lagonigro et al., 2004). Для исключения контаминации библиотек кДНК примесями геномной ДНК тотальную РНК обрабатывали ДНКазой “Turbo” (Ambion, США).

Синтез первой цепи кДНК. На тотальной РНК синтезировали первую цепь кДНК с использованием наборов Omniscript RT Kit (Quiagen,) и High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, США). Были получены кДНК библиотеки из всех указанных в разделе «Объекты исследования» тканей глаза.

Праймеры и зонды для ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени конструировали с помощью компьютерных программ DNAStar (США), Beacon Designer (США) и Primer Express (США) и анализа данных международной базы NCBI о структуре исследуемых генов. Праймеры для генов Fgf2, Pitx1 конструировали на основе гомологичных участков известных нуклеотидных последовательностей соответствующих генов у других видов амфибий и рыб. При конструировании праймеров для генов Otx2, Pax6 и Six3 использовали данные о структуре соответствующих генов тритона P. waltl. Для исключения получения ПЦР-продукта на матрице хромосомной ДНК, помимо обработки тотальной РНК ДНКазой, праймеры подбирали на основе анализа нуклеотидных последовательностей из разных экзонов с учетом требований для оптимальных условий проведения ПЦР в режиме реального времени. Праймеры были синтезированы фирмами «Литех», «Синтол» и «ДНК-Синтез» (Россия).

ОТ-ПЦР и анализ нуклеотидных последовательностей. Полуколичественную оценку и определение тканеспецифичности экспрессии исследуемых генов проводили методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами (Литех, Россия), на матрице кДНК, используя набор для амплификации, содержащий ColoredTaq полимеразу (Силекс М, Россия), и амплификатор Eppendorf Mastercycler (Eppendorf, Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в агарозном геле (Amresco, США) в трис-ацетатном буфере с бромистым этидием (Sigma, США). Оценку интенсивности свечения продуктов ПЦР проводили на УФ-трансиллюминаторе (BIO-RAD, США) с помощью программы QuantityOne (BIO-RAD, США). Для секвенирования ПЦР-фрагменты элюировали из агарозы с помощью наборов GeneСlean (BIO 101 Inc., США) или MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). При анализе нуклеотидных последовательностей использовали алгоритм Clustal W из пакета программ DNASTAR7 (DNASTAR Inc., США).

ПЦР в реальном времени. Для количественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК из анализируемых тканей (регенераты на 8, 14, 20 сутки после операции, интактные РПЭ и сетчатка) была предварительно отнормирована по генам Gapdh и Ef1a, т.н. “housekeeping genes” (Zhang et al., 2000). ПЦР в реальном времени проводили на ДНК амплификаторе «Applied Biosystems 7500» (Applied Biosystems, США) и «Rotor-Gene 3000» (CorbettResearch, Австралия). Использовали готовые компоненты реакции производства ЗАО «Синтол» (Россия). Рабочие концентрации специфических праймеров и зонда составляли 10 пкМ и 5пкМ, соответственно. Температурные и временные условия реакции отработаны эмпирическим путем.

Статистическая обработка данных. Каждую реакцию проводили не менее трех раз. Определяли значения Сt, полученные для каждого из анализируемых генов и генов эндогенного контроля. Данные считали достоверными при р<0,05, где р - показатель статистической значимости (достоверности) данных. Определение среднего арифметического значения, среднего квадратичного отклонения, ошибки средней арифметической и абсолютной вероятной погрешности проводили при помощи программы Microsoft Office Exсel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация гомолога гена Fgf2. С помощью праймеров, сконструированных на основе гомологичных участков нуклеотидных последовательностей, соответствующих мРНК гена Fgf2 амфибий Xenopus laevis, Cynops pyrrhogaster, впервые был получен ПЦР-фрагмент (размером 252 н.п.) из кДНК тритона P. waltl. Секвенирование ПЦР-фрагмента и структурный анализ нуклеотидной последовательности, проведенный с помощью программы NCBI BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ), доказали его принадлежность гену Fgf2. Процент гомологии нуклеотидной последовательности полученного ПЦР-продукта с нуклеотидными последовательностями мРНК гена Fgf2 Bos taurus, Ovis aries и Cynops pyrrhogaster, составил 78.7%, 80.3% и 99.6%, соответственно. Процент гомологии аминокислотной последовательности, кодируемой полученным ПЦР-продуктом, с аминокислотными последовательностями белка Fgf2 B. taurus, O. aries и C. pyrrhogaster составил 86.7%, 89.2% и 100%, соответственно.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.