WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Исследование мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию фактора транскрипции trf2 в эмбриогенезе drosophila melanogaster

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Бурдина Наталья Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАЦИЙ LEG-ARISTA-WING COMPLEX,

НАРУШАЮЩИХ ЭКСПРЕССИЮ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ TRF2

В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ Drosophila melanogaster

Специальность: 03.03.05 – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории генетических основ морфогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Симонова Ольга Борисовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Васецкий Сергей Григорьевич

кандидат биологических наук

Тиллиб Сергей Владимирович

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН.

Защита диссертации состоится « 28 » _апреля_ 2010 г. в _14.00_ часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:

119334, Москва, ул. Вавилова, д.26.

Сайт: http://idbras.comcor.ru/;

E-mail:idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « »_________ 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук /Абрамова Е.Б./

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эмбриогенез дрозофилы является удобной модельной системой для изучения морфогенеза. Морфогенетические события, охарактеризованные у дрозофилы, имеют много общего с механизмами, контролирующими морфогенез у позвоночных животных. Например, во время спинного закрытия морфогенез у эмбриона дрозофилы схож с процессами эпиболии и ранозаживления у позвоночных животных. Считается, что эти морфогенетические процессы происходят благодаря ведущим эктодермальным краевым клеткам, специфичность которых определяется экспрессией ряда определённых генов. Эмбриональное ранозаживление у позвоночных животных, в отличие от ранозаживления у взрослых особей, происходит без формирования рубца и является примером феномена, подобного спинному закрытию дрозофилы. В настоящее время ведётся активный поиск генов-участников этого процесса, а дрозофила может служить удобным модельным объектом.

Другим морфогенетическим событием в эмбриогенезе дрозофилы является инвагинация мезодермы в вентральной борозде. Во время гаструляции у части вентральных мезодермальных прекурсорных клеток происходит высоко скоординированное сокращение (сжимание) апикальной поверхности. Этот процесс способствует сначала инвагинации, а затем и формированию трубки, состоящей из клеток вентральной борозды. У эмбриона мыши смыкание нервной трубки является зеркальным отражением процесса формирования вентральной борозды дрозофилы. Эти факты позволяют предположить, что молекулярные программы, лежащие в основе таких процессов, как спинное закрытие и формирование вентральной борозды, эволюционно-консервативны.

Сейчас хорошо описаны отдельные изменения формы клеток, свойственные каждому морфогенетическому процессу, однако, недостаточно изучена роль конкретных факторов транскрипции, активирующих экспрессию регуляторов морфогенеза. Эти трудности часто связаны с отсутствием удобных для исследования мутаций генов, кодирующих подобные факторы.

Недавно было показано, что гомолог гена человека, кодирующего альтернативный фактор базовой транскрипции TBP (TATA-box Binding Protein) Related Factor 2 (TRF2), у дрозофилы проявляет заметную специфичность и может контролировать экспрессию определённого набора генов, участвующих в развитии. Исследовать in vivo функции этого гена помогло открытие многочисленных видимых и летальных его мутаций, названных lawc (leg-arista-wing complex), локализованных на достаточном расстоянии от открытой рамки считывания этого гена, однако, основательно снижающих его экспрессию. Фенотипическое проявление этих мутаций достаточно чётко указывает на участие комплекса lawc/Trf2 в сигнальных путях, контролирующих морфогенез на всех этапах развития дрозофилы.

Как оказалось, кодирующий район мРНК lawc/Trf2 дрозофилы содержит дополнительный альтернативный сайт инициации трансляции, благодаря которому с одной мРНК синтезируются две изоформы белка (полноразмерная - GenBank#DQ162845 и укороченная - GenBank#NM078529), отличающиеся N-концевыми последовательностями. Недавно изолированы летальные мутации, нарушающие либо экспрессию эволюционно-консервативной укороченной изоформы TRF2, либо экспрессию только полноразмерной изоформы TRF2, либо только её эволюционно-вариабельного N-концевого домена. Однако их влияние на развитие Drosophila не исследовалось.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в изучении у D. melanogaster особенностей эмбриогенеза мутантов leg-arista-wing complex, c нарушенной экспрессией фактора транскрипции TRF2.



В работе были поставлены следующие задачи:

  1. определить стадии летальности мутантов в линиях с различными lawc- аллелями;
  2. провести морфологический анализ кутикулы погибших эмбрионов с нарушенной экспрессией:

а/ эволюционно-консервативной укороченной изоформы TRF2;

б/ полноразмерной изоформы TRF2;

в/ эволюционно-вариабельного N-концевого района полноразмерной изоформы TRF2;

  1. исследовать материнский эффект гена lawc/Trf2 на эмбриогенез;
  2. определить особенности сегментации и формирования вентральной борозды и периферической нервной системы у мутантных эмбрионов с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания;
  3. определить молекулярную природу мутации lawcp1, двух её летальных производных, и летальной мутации lawcEF520 методом полимеразной цепной реакции и секвенирования районов открытой рамки считывания, кодирующей белок TRF2.

Научная новизна и практическая ценность работы. Ген leg-aristae-wing complex/TBP related factor 2 (lawc/Trf2), кодирующий у дрозофилы фактор базовой транскрипции, гомологичный фактору базовой транскрипции человека, продуцирует две изоформы белка – полноразмерную и укороченную. Впервые было показано, что эмбрионы с пониженной экспрессией каждого из его продуктов погибают из-за повреждений, вызванных аномалиями в морфогенетических событиях, схожих с процессами ранозаживления и формирования нервной трубки у позвоночных животных. Впервые было показано, что эволюционно вариабельный N-концевой домен полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функцией, заключающейся в контроле миграции и слияния трахейных ветвей, формирующих дыхательную систему зародыша. Впервые были идентифицированы и молекулярно исследованы четыре мутации, нарушающие кодирующий район гена lawc/Trf2. Были получены новые данные, указывающие на специфическое участие полноразмерной изоформы в формировании нервной системы эмбриона. Впервые исследован материнский эффект гена lawc/Trf2. Он выражается в нарушении синхронности первых делений-дроблений ядер эмбрионального синцития.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2006; 2007; 2008); на международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое применение» (Москва, 2006); на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007); на международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007) и на 47-й, 49-й и 50-й ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008; Чикаго, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 2, тезисов докладов и материалов конференций – 10.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ____ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы ( ___ источников) и приложения. Содержит ___ рисунков ___ и ___ таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнялись на плодовой мушке Drosophila melanogaster.

В работе использовалась 31 уникальная линия с летальными мутациями в районе lawc/Тrf2, которые были получены в лаборатории генетических основ морфогенеза (ИБР РАН), и девять линий, полученных из коллекционного центра линий дрозофилы (Блумингтон, США). Линия lawcp1/lawcEF520 использовалась для исследования материнского эффекта гена lawc/Тrf2. Для определения стадии летальности использовалась трансгенная линия, содержащая в балансерной хромосоме конструкт, экспресирующий зеленый флуоресцентный белок GFP.

При приготовлении препаратов кутикулы погибших эмбрионов хорион удаляли вручную, кутикулу просветляли в капле раствора Хойера с добавлением 30% молочной кислоты в течение часа при 60°С.

Восстановление жизнеспособности (rescue–тест) проводили генетическими методами. В rescue-экспериментах использовали трансгенные линии, содержащие генетические конструкты, конститутивно экспрессирующие TRF2. Созданные конструкции были инъецированы в полярную плазму эмбриона дрозофилы на стадии прецеллюлярной бластодермы.

Для получения амплифицированных фрагментов ДНК мы использовали метод ПЦР на матрице геномной ДНК Drosophila melanogaster линий: lawcp1 ; lawc19/FM4; lawc69/FM4 и lawcEF520/FM7c. Были использованы пятнадцать пар 5’- и 3’-праймеров, охватывающих область около 6 т.п.н. (рис. 10) геномной последовательности, кодирующей ген Trf2. (Праймеры были синтезированы в компании ООО «Литех», Россия). Данные обрабатывали с помощью компьютерных программ DNASTAR и CHROMAS.

Для определения точных границ делеции, нарушающей как укороченную, так и полноразмерную изоформы TRF2, ПЦР-фрагмент, несущий делецию, был клонирован в плазмиду pGEM-T. Полученная конструкция pGEM-T TRF520 была секвенирована в КЦП «Геном» (ИМБ РАН).

Исходная конструкция [TRF2-1] несла кДНК, кодирующую укороченную изоформу TRF2, и была ранее клонирована в вектор pl3FRT для трансформации дрозофил. Конструкция была создана в лаборатории П.Г. Георгиева (ИБГ РАН) и была нам любезно предоставлена (рис. 1Б).

Для наших целей кДНК короткой изоформы TRF2 из вектора pl3FRT была переклонирована в плазмиду pSK (pBluescript, Stratagene) по сайтам рестрикции XhoI и BamHI. Далее в полученную конструкцию, названную pSK-TRF2, по сайтам рестрикции NheI и EcoRI был вставлен фрагмент, содержащий анализируемую делецию девяти нуклеотидов, который был предварительно вырезан по этим же сайтам рестрикции из конструкции pGEM-T TRF520 (рис. 1А). Таким образом, исходный фрагмент кДНК был заменен соответствующим фрагментом, содержащим делецию. Затем фрагмент мутантной кДНК из pSK-TRF520 по сайтам рестрикции XhoI и BamHI был снова клонирован в вектор pl3FRT.

Созданная конструкция [TRF520] (рис. 1В) была инъецирована в полярную плазму 350 эмбрионов дрозофилы линииw1118 (белые глаза) на стадии прецеллюлярной бластодермы. Выживаемость после инъецирования составила 55%. Далее было поставлено более 200 аналитических скрещиваний с дрозофилами линии w1118 (белые глаза). Было получено 11 независимых трансформантов (пигментированные глаза) с независимыми встраиваниями конструкции в разные хромосомы. Эффективность трансформации составила 6%. Эти экспериментальные линии получили рабочее название TRF520.

 Схема получения конструкции pSK-TRF520 (А) и схемы векторов для-0  Схема получения конструкции pSK-TRF520 (А) и схемы векторов для-1 Схема получения конструкции pSK-TRF520 (А) и схемы векторов для-2 Рис. 1. Схема получения конструкции pSK-TRF520 (А) и схемы векторов для трансформации дрозофил pl3FRT конструкциями [TRF2-1] (Б) и [TRF520] (В). Обозначения: А: стрелками обозначены области конструкций; вертикальными пунктирными линиями обозначена клонированная область с делецией (открытый треугольник), XhoI, NheI, EcoRI, BamHI - сайты рестрикции, используемые в клонировании. Б и В: 5’P и 3’P - 5’и 3’ инвертированные концевые повторы Р-элемента; FRT- специфические дрожжевые сайты для FLP рекомбиназы; mini-white – адаптированная копия селекторного гена white, необходимая для отбора успешно трансформированных дрозофил по цвету глаз. Promoter Su(Hw) - конститутивный промотор гена Suppressor of Hairy-wing., волнистые линии - pUC- плазмидная основа для наращивания в Е.coli;


Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.