WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Выявление и активация in vitro скрытых регенерационных потенций сетчатки глаза позвоночных животных

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

НОВИКОВА

ЮЛИЯ ПЕТРОВНА

Выявление и активация in vitro скрытых регенерационных потенций сетчатки глаза позвоночных животных

03.03.05 – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

ГРИГОРЯН Элеонора Норайровна,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

БРОДСКИЙ Всеволод Яковлевич

доктор биологических наук

КАЛАМКАРОВ Григорий Рафаэлевич

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова. Биологический факультет, кафедра эмбриологии

Защита диссертации состоится « 28 » апреля 2010 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:

119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан «___»______________2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Абрамова Е.Б. ele0806@yandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Многие заболевания глаза, приводящие к потере зрения, такие как пигментный ретинит, отслойка сетчатки, связанная с возрастом макулярная дистрофия, заболевания сетчатки при диабете и глаукоме сопровождаются гибелью нейронов сетчатки. Для того чтобы научиться лечить эти и другие заболевания сетчатки необходимо, в частности, выявить клеточные источники регенерации и найти способы их стимулировать.

У взрослых млекопитающих поврежденная сетчатка, как и другие отделы ЦНС, не регенерирует, а погибшие клетки не могут быть замещены образующимися de novo. Это связано с потерей способности ретинальных клеток взрослых млекопитающих к пролиферации и жестко стабилизированной дифференцировкой нейронов сетчатки. Тем не менее, это не означает, что эта ткань не располагает скрытыми внутренними клеточными источниками и механизмами для восстановления. Последние годы характеризуются наиболее активным поиском этого ресурса, локализующегося как внутри самой сетчатки, так и вне ее, но в пределах глаза.

В работе было показано, что 3D органотипическое длительное культивирование позволяет не только следить за процессами реконструкции сетчатки, но и выявить в ней популяции пролиферирующих и дедифференцированных клеток. В результате возникло предположение, что при таком способе культивирования “молчащие” клетки-предшественники могут быть стимулированы к делениям, а в дальнейшем, при направленном воздействии, и к развитию в нейрональном направлении. В перспективе это может дать возможность накапливать клетки предшественники, необходимые для восполнения нейронов, утраченных в результате повреждения или заболеваний сетчатки.

Цель и задачи исследования.

Выявление в сетчатке высших и низших позвоночных животных клеток, способных при повреждении сетчатки в условиях культивирования in vitro и in vivo к пролиферации и трансформации фенотипа.

Увеличение пула потенциальных клеточных источников регенерации с помощью фактора роста фибробластов (FGF2) и митохондриального антиоксиданта (SkQ1).

В работе предстояло решить следующие задачи:

  • С помощью метода постоянной доставки предшественника синтеза ДНК изучить in vivo популяции клеток сетчатки тритона, способные входить в пролиферативную фазу при длительной отслойке от ретинального пигментного эпителия (РПЭ).
  • Разработать условия роллерного органотипического культивирования in vitro для тканей глаза высших позвоночных.
  • Изучить морфологические изменения в сетчатке и РПЭ в условиях долговременного культивирования этих тканей in vitro.
  • На основании иммунохимических и морфологических критериев определить локализацию и фенотипы пролиферирующих клеток сетчатки тритона и крысы при культивировании in vitro.
  • Исследовать профиль экспрессии генов-маркеров дифференцировки до и после культивирования сетчатки и РПЭ тритона in vitro.
  • Изучить влияние фактора роста фибробластов (FGF2) и митохондриального антиоксиданта SkQ1 на жизнеспособность, пролиферативную активность и изменение фенотипа клеток тканей глаза в условиях in vitro.

Научная новизна работы.

Впервые проведено длительное органотипическое 3D-культивирование целой сетчатки и РПЭ, полученных из глаз взрослых позвоночных животных разных классов (тритон и крыса). Работа позволила впервые выявить скрытые, индуцированные условиями культивирования, регенерационные свойства этих тканей. Было показано, что РПЭ взрослых и тритона, и крысы сохраняет потенции к проявлению черт нейральных клеток предшественников, однако более глубокие изменения по пути ретинальной дифференцировки присущи только РПЭ тритона, где FGF2 является одним из основных регуляторов процесса. В сетчатке обоих видов определены типы клеток, обладающих митотической активностью и способностью к миграции. Впервые показана возможность усиления выявленных регенерационных ответов с помощью антиоксиданта SkQ1 в сетчатке тритона, путём предотвращения гибели пролиферирующих и вновь образующихся дедифференцированных клеток, а в РПЭ крысы путём существенного снижения не только клеточной гибели, но и проявления патологических изменений в РПЭ, а именно ингибирования трансформации его клеток в макрофагальный фенотип.



Научная и практическая значимость работы.

Данная работа по органотипическому культивированию целых сетчатки и РПЭ взрослых тритона и крысы осуществлена впервые и позволила выявить скрытые, индуцированные условиями культивирования, регенерационные свойства этих тканей.

Использованный подход является хорошим новым инструментом для изучения регенераторного потенциала сетчатки и его сравнения у низших и высших позвоночных. Выбранные условия культивирования индуцируют не только пролиферацию, но также дедифференцировку и миграцию клеток, что позволит в дальнейшем изучать молекулярные механизмы этих процессов, а также накапливать in vitro малодифференцированные клетки для применения их в трансплантации.

Этот подход позволяет осуществлять поиск способов подавления нежелательного с точки зрения патологии сетчатки клеточного поведения и, напротив, индукции ответов, способствующих регенерации.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных морфологических, иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Москва, 12 декабря 2007г., 16 декабря 2008 г.); на XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 19-24 октября 2008 г.); на конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 17-18 ноября 2005 г.); на второй (10-15 сентября 2006 г., Швейцария) и третьей (5-10 октября 2008, Испания) Европейской конференции по регенерации (European Conference on Regeneration); на научно-практической конференции «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения» (Москва, НИИ глазных болезней им. Гельмгольца, 23-24 апреля 2008 г.), на школе-конференции «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 6-10 октября 2008 г.); на всероссийской научной школе - конференции для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (21-26 сентября 2009 г. Москва); на всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино. 24-25 мая 2007 г.); на конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, ноябрь 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 15.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 206 страницах, содержит 34 рисунка, 3 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 354 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были взрослые тритоны Pleurodeles waltl (Urodela) и взрослые (2 месяца) крысы альбиносы Wistar.

Операция по отслойке сетчатки у тритона in vivo. В эксперименте in vivo использовали модель отслойки сетчатки от РПЭ в глазу тритона (Григорян и др., 1996). После анестезии животных (MS-222, 1:1000) микрохирургически делали поперечный разрез роговицы и удаляли хрусталик. При изоляции хрусталика вытекала стекловидная жидкость, и падало внутриглазное давление, что приводило к незначительной отслойке сетчатки, которую увеличивали за счет создания напряжения по лимбу при помощи стеклянной палочки с закрытым шариком на конце. Отслойку регистрировали через просвет зрачка. После операции животных размещали на гигроскопичной подложке из поливинилформаля, пропитанной раствором предшественника синтеза ДНК – 5’- бром-дезоксиуридином (БрдУ).

Культивирование in vitro. Роллерное органотипическое 3D-культивирование целой сетчатки взрослых тритонов и крыс осуществляли в роллере (RM-1, Латвия). Время культивирования тканей глаза тритонов составляло 2, 3 и 4 недели, крыс – 7-10 суток. Ткани глаза тритонов культивировали со скоростью вращения 40 об/мин при температуре 20С и смене среды раз в неделю; ткани глаза крысы - со скоростью вращения 60 об/мин при температуре 35.5С и однократной смене среды. Среда культивирования для тканей глаза тритона состояла из среды 199 (70%), дистиллированной воды (30%), буфера HEPES (30 мкл на 100 мл среды), гентамицин сульфата (200 мкл на 100 мл среды) и 10%-ной эмбриональной бычьей сыворотки (10 мл на 100 мл среды); для тканей глаза крысы - среда ДМЕМ, 10%-ная эмбриональная телячья сыворотка (10 мл на 100 мл среды), L-глутамин (300 мг на 500 мл среды) и гентамицин, добавленный из расчета 500 мкл на 500 мл среды.

Гистологическое исследование. После окончания культивирования часть материала фиксировали в растворе Буэна. Для морфологического анализа применяли методику окрашивания клеток гематоксилином по Караччи с докрашиванием эозином, а анализ изображений и их регистрацию проводили с помощью светового микроскопа Olympus AH-3 (Австрия).

Приготовление криосрезов. Ткани глаза после культивирования фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на 0.1 M PBS (pH 7.4), в течение 24 ч при +40C. Затем отмывали в 3-х сменах 0.1 M PBS и последовательно выдерживали в 5% и 20% сахарозе. Ткани ориентировали в блоках и замораживали при -70°С в Tissue Tec O.C.T. (Leica, Германия). На криостате получали поперечные срезы толщиной 10 мкм. Перед инкубацией с антителами срезы отмывали в 0.1 М PBS (30 мин).

Иммунохимический анализ. Перед инкубацией с первичными антителами срезы обрабатывали (30 мин) в 0.1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma) на буфере, вновь отмывали и инкубировали в растворе, увеличивающем проницаемость антител (0.25% Triton X-100 (Sigma, США) на 0.1%-ном растворе Tween/PBS (Sigma, США)). После этого проводили обработку первичными антителами (t = 200С, в течение ночи).

Растворы первых антител включали 5-10% готового раствора BSA для устранения неспецифического связывания и 0.3% Triton X-100 - для улучшения проницаемости для первичных антител. Список использованных антител представлен в таблице 1. После инкубации с первичными антителами срезы отмывали PBS и наносили вторичные антитела, IgG конъюгированные c FITC, TRIC и Alexa Fluor 488 или 546 (Sigma и Molecular Probes, США). В ряде случаев в качестве вторичных антител применяли меченные пероксидазой антитела и реакцию проявления окраски с DAB (все Sigma).

Таблица 1. Антитела, используемые для иммуноцитохимии.

Антитела Фирма Разведение
Mouse monoclonal anti BrdU Sigma 1 : 500
Mouse monoclonal anti PCNA Sigma 1 : 100
Mouse monoclonal anti NF-200 Sigma 1: 100
Rabbit polyclonal anti recoverin МГУ 1:20
Rabbit polyclonal anti GFAP Sigma 1 : 50
Mouse monoclonal anti Clone LN-5 Sigma 1:100
Mouse monoclonal anti III-tubulin Sigma 1:500






Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.