WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

НИКИТИНА

Любовь Сергеевна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ АПОПТОЗА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ВАЗОПРЕССИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА

03.03.01 – Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Черниговская Елена Валерьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Аврова Наталья Федоровна

доктор биологических наук,

Ордян Наталья Эдуардовна

Ведущее научное учреждение: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

Защита диссертации состоится «9» февраля 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).

Автореферат разослан «______» _____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследование сигнальных белков апоптоза в настоящее время в основном сфокусировано на анализе механизмов их взаимодействия в процессе регуляции клеточного цикла и апоптоза различных типов клеток. Особенный интерес вызывает роль белков апоптоза в нейронах, пролиферация и массовая программированная гибель которых заканчивается в раннем онтогенезе, но белки апоптоза продолжают синтезироваться в дифференцированных нейронах в течение всей жизни организма. Существование экспрессии сигнальных белков апоптоза в дифференцированных жизнеспособных нейронах позволяют предположить возможность их участия в процессах напрямую с апоптозом не связанных, однако данных об участии белков апоптоза в регуляции нейрональной активности в настоящее время чрезвычайно мало. В частности, было показано, что белки семейства BCL-2 (B-cell lymphoma 2), помимо регуляции митохондриального пути апоптоза [Kroemer et al., 1997], участвуют в регуляции роста аксонов [Jiao et al., 2005], и необходимы для осуществления синаптической пластичности [Fannjiang et al., 2003; Hickman et al., 2008; Jonas et al., 2003]. Транскрипционный фактор p53 (tumor protein 53) также является полифункциональным белком. Помимо регуляции клеточного цикла и апоптоза [Lane, 1993], p53 также участвует в регуляции экспрессии глюкокортикоидных рецепторов [Nishimura et al., 2004].

На основании результатов, полученных Черниговской с соавторами, и исходя из литературных данных, очевидно, что Bcl-2 и p53 экспрессируются в значительном количестве в нейронах ЦНС, в частности, в гипоталамических нейронах у взрослых интактных животных. Показано, что стресс, в том числе дегидратация (специфическое воздействие, вызывающее активацию вазопрессинергических нейросекреторных клеток) приводит к усилению экспрессии в них белков апоптоза (Bcl-2, p53), не вызывая гибель нейронов [Chernigovskaya et al., 2005; Nishimura et al., 2004]. Более того, показано, что нокаут генов, кодирующих p53 и Bcl-2, влияет на специфические функции вазопрессинергических и катехоламинергических нейронов на уровне синтеза и выведения нейрогормонов из тел клеток [Chernigovskaya et al., 2005], что свидетельствует о важной роли белков апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов. Очевидно, что белки апоптоза не являются основными регуляторами функциональной активности нейронов. Более вероятно, что Bcl-2 и p53 оказывают модулирующее влияние на биосинтез нейропептидов. Однако непосредственные мишени Bcl-2 и p53 в регуляции функциональной активности нейронов мозга пока не обнаружены.

Показано, что Bcl-2 и p53 активируют ERK1/2 сигнальный каскад (киназный каскад, регулируемый внеклеточными сигналами) [Singh et al., 2007; Wang et al., 1996], который, вовлечен в регуляцию пролиферации и дифференцировки клеток [Pearson et al., 2001]. Кроме того, существуют немногочисленные данные об участии ERK1/2 каскада в регуляции биосинтеза ряда нейротрансмиттеров [Arima et al., 2002; Ma et al., 2005]. Взаимодействие ERK1/2 каскада с сигнальными белками апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов не изучалось.

Вазопрессинергические нейросекреторные нейроны гипоталамуса являются хорошей моделью для изучения возможности и механизмов участия Bcl-2 и p53 в регуляции нейрональной активности в связи с высокой секреторной активностью этих нейронов, позволяющей дифференциально оценивать изменения уровня синтеза и темпов выведения вазопрессина. Механизмы регуляции транспорта и выведения вазопрессинергических секреторных гранул к настоящему времени остаются слабо изученными. Анализ малочисленных литературных данных показал, что одним из белков, непосредственно осуществляющих антероградный транспорт, может быть кинезин [Senda, Yu, 1999]. Непосредственное изучение роли кинезина в реализации антероградного транспорта вазопрессина также практически не проводилось. Механизмы регуляции биосинтеза вазопрессина исследуются уже на протяжении нескольких десятилетий, и на первый взгляд являются хорошо изученными. Одним из ключевых факторов, отвечающих за транскрипцию вазопрессина нейронами гипоталамуса, является цАМФ. Промотор гена вазопрессина содержит CRE (cAMP response element), с которым связывается транскрипционный фактор CREB (cAMP response element binding protein), который в вазопрессинергических нейросекреторных нейронах гипоталамуса регулируется преимущественно протеинкиназой А [Burbach et al., 2001]. На основании экспериментов in vitro в различных типах клеток показано, что в фосфорилировании и активации CREB помимо протеинкиназы А, участвуют также другие протеинкиназы, в том числе относящиеся к ERK1/2 каскаду [Johannessen et al., 2004]. Более того, существуют данные об участии ERK1/2 сигнального каскада в регуляции циркадианного ритма экспрессии гена вазопрессина нейронами супрахиазматического ядра [Arima et al., 2002]. Несмотря на то, что протеинкиназа А очевидно не является единственной киназой, регулирующей транскрипцию вазопрессина за счет активации транскрипционного фактора CREB, данных о возможном участии ERK1/2-каскада в регуляции экспрессии вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса в литературе найдено не было.



Таким образом, очевидна необходимость детального исследования взаимодействия сигнальных белков апоптоза Bcl-2 и p53 с ERK1/2-каскадом и транскрипционным фактором CREB в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса. Актуальность изучения этой проблемы основана на важности понимания механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с другими внутриклеточными посредниками в функционировании клетки в физиологических условиях и при патологии.

Целью исследования было изучение механизмов влияния сигнальных белков апоптоза на функциональную активность вазопрессинергических нейронов гипоталамуса крыс. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Задачи:

  1. Оценить возможность участия, характер и механизмы влияния ERK1/2 сигнального каскада на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса.
  2. Исследовать характер прямого влияния антиапоптозного белка Bcl-2 на активность киназ ERK1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Elk1 и CREB, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами гипоталамуса.
  3. Изучить характер прямого влияния проапоптозного белка p53 на активность киназ ERK1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Elk1 и CREB, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами супраоптического ядра.

Научная новизна

Впервые была выявлена активация киназ ERK1/2 каскада и транскрипционных факторов Elk1 и CREB в вазопрессинергических нейронах гипоталамуса при водной депривации. Впервые было установлено, что киназы ERK1/2 сигнального каскада участвуют в регуляции синтеза и секреции вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса. Была показана зависимость распределения транспортного белка кинезина от активности ERK1/2 киназы.

Впервые было установлено активирующее влияние антиапоптозного белка Bcl-2 и транскрипционного фактора CREB на активность синтеза вазопрессина.

Впервые было выявлено активирующее влияние p53 на секрецию вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса, выражавшееся в регуляции транспорта и выведения нейрогормона. Было показано, что p53 влияет на интенсивность секреции вазопрессина за счет активации ERK1/2 киназы.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. ERK1/2 сигнальный каскад вызывает активацию транскрипционных факторов Elk1 и CREB, что приводит к усилению синтеза вазопрессина нейронами гипоталамуса, а также участвует в регуляции секреции вазопрессина, вызывая увеличение синтеза транспортного белка кинезина.
  2. Антиапоптозный белок Bcl-2 и транскрипционный фактор CREB участвуют в активации синтеза вазопрессина независимо от ERK1/2 сигнального каскада.
  3. Проапоптозный белок p53 оказывает модулирующее активирующее действие на секрецию вазопрессина, и это влияние опосредовано ERK1/2 киназой.

Теоретическая и практическая значимость

Исследование имеет фундаментальное значение для понимания роли сигнальных белков апоптоза Bcl-2 и p53 в модуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов, что открывает новые перспективы в изучении взаимозависимости функциональной активности нейронов и их жизнеспособности. Понимание механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с внутриклеточными посредниками лежит также в основе разработки новых подходов к лечению онкологических заболеваний, а также ряда нейродегенеративных заболеваний, патогенез которых связан с нарушением баланса про- и антиапоптозных белков. Более того, к настоящему времени блокаторы Bcl-2 и p53 (HA14-1 и Pifithrin- соответственно) используются в терапии онкологических заболеваний периферических тканей, в связи с чем необходимо учитывать возможность влияния этих фармакологических агентов на центральную нервную систему. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтах.





Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на 1 Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на XIII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на 5 международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения-2006» (Санкт-Петербург, 2006), на 6-th ICN (Питтсбург, США 2006), на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» ( Санкт-Петербург, 2007), на Международной конференции «Apoptosis World 2008. From mechanisms to applications» (Люксембург, 2008), на Конференции с международным участием “Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга” (С.-Петербург, 2008), на 11-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователь «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), на 4th Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders (Лейпциг, Германия, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, 2 из которых – статьи в рецензируемых журналах, 17 тезисов докладов.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при содействии Российского Фонда Фундаментальных исследований (проекты 05-04-48099 и 08-04-00028)

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 16 отечественных и 165 зарубежных источников. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 49 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения возможности участия сигнальных белков апоптоза и киназ ERK1/2 сигнального каскада в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса мы провели эксперименты, в которых взрослых крыс линии Вистар подвергали водной депривации. Животных опытной группы (n=11) в течение 3-х дней содержали в клетках со свободным доступом к сухому корму, но без воды. Крысы контрольной группы (n=11) имели свободный доступ к воде и корму. Животных декапитировали по окончании водной депривации.

Для изучения механизмов влияния p53 на активность вазопрессинергических клеток супраоптического ядра были проведены эксперименты in vivo. Селективный блокатор p53 Pifithrin- вводили крысам (n=11) внутрибрюшинно в концентрации 2 мг/кг. Животным контрольной группы (n=11) вводили растворитель блокатора диметилсульфоксид (ДМСО) на физиологическом растворе в концентрации 0,5%. Животных декапитировали через 5 часов после введения растворов.

Для исследования механизмов прямого влияния p53 и Bcl-2 были проведены опыты in vivo с внутригипоталамическим введением блокаторов Bcl-2 – HA14-1 и p53 – Pifithrin-. Для введения блокаторов за 7-10 дней до начала экспериментов наркотизированным крысам (нембутал в дозе 60мг/кг, интраперитонеально) вживляли проводящие канюли в область третьего желудочка мозга (AP1,4; L0,8; H6,5 в мм в соответствии со стереотаксическим атласом [Paxinos, Watson, 1998]). В работе были использованы 3 группы животных (n=15). Крысам контрольной группы вводили растворитель блокаторов (физиологический раствор, содержащий 0,5% ДМСО). Крысам второй группы вводили НА14-1 - блокатор Bcl-2 (0,5 мг/кг). Животные третьей группы были подвергнуты введению Pifithrin- в дозе 0,25 мг/кг. Фармакологические агенты вводились дважды за 36 часов и за 8 часов до забора материала. Также, через 2 часа после каждого введения блокаторов, у животных всех экспериментальных групп оценивали уровень диуреза в течение двух часов в метаболических камерах. Крыс декапитировали на 8-11 день после имплантации канюль через 8 часов после последнего введения фармакологических агентов.

Для изучения прямого влияния инактивации Bcl-2, p53 или ERK1/2 сигнального каскада на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра, были выполнены эксперименты in vitro с использованием блокаторов HA14-1, Pifithrin- или UO126 соответственно. Исследования in vitro проводились на переживающих срезах гипоталамуса. Животных (n=66) декапитировали, быстро извлекали мозг и в стерильных условиях из гипоталамической области иссекали срезы толщиной около 600 мкм. Для экспериментов с использованием блокаторов HA14-1 и UO126 иссекались фронтальные срезы гипоталамуса, содержащие супраоптические и паравентрикулярные ядра. Для экспериментов с применением блокатора Pifithrin- иссекались горизонтальные срезы, содержание супраоптические, паравентрикулярные ядра и гипофиз. Срезы инкубировались в СО2 инкубаторе в среде ДМЕМ, содержащей 20% инактивированной сыворотки крови лошади и антибиотики (пенициллин в дозе 50 мкг/мл среды и стрептомицин – 100 мкг/мл), в течение 30 минут при температуре 370С, концентрации СО2 5% и влажности 95%. Затем среду меняли на инкубационную среду такого же состава, содержащую блокаторы (HA14-1 в дозе 30 мкМ или Pifithrin- в дозе 10 мкМ или UO 126 в дозе 25 мкМ), или растворители блокаторов (ДМСО в концентрации 0,5%) в качестве контроля. Срезы инкубировались в течение 5 часов.

По окончании всех экспериментов по 5 мозгов или срезов гипоталамуса на группу фиксировали 4% формальдегидом для дальнейшего морфологического исследования. Из другой части мозгов или срезов иссекали супраоптические ядра и заднюю долю гипофиза, которые далее гомогенизировали в буфере, содержащем блокаторы пептидаз и фосфатаз, для последующего биохимического анализа.

Иммуногистохимия



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.