WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Механизмы блокады nmda и ampa рецепторов трициклическими соединениями

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

БАРЫГИН

Олег Игоревич

МЕХАНИЗМЫ БЛОКАДЫ NMDA И AMPA РЕЦЕПТОРОВ ТРИЦИКЛИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

03.03.01 – Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Тихонов Денис Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Кривой Игорь Ильич

доктор биологических наук

Антонов Сергей Михайлович

Ведущее научное учреждение: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится «9 марта» 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).

Автореферат разослан «______» _____________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глутамат – это наиболее распространенный возбуждающий медиатор в центральной нервной системе позвоночных животных (Curtis et al., 1959). Свое быстрое постсинаптическое действие он опосредует через ионотропные глутаматные рецепторы, принадлежащие к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов (Dingledine et al., 1999).

Чрезмерная активация ионотропных глутаматных рецепторов вовлечена во многие патологические состояния (Lipton & Rosenberg, 1994). К их числу относятся, например, болезни Паркинсона (Johnson et al., 2009) и Альцгеймера (Koutsilieri & Riederer, 2007), глаукома (Seki & Lipton, 2008). При шизофрении, напротив, наблюдается пониженная активность NMDA рецепторов (Stone, 2009). К настоящему моменту известно множество блокаторов этих ионных каналов, однако их применение в клинической практике затруднено из-за серьезных побочных эффектов у большинства соединений. Действие каналоблокаторов характеризуется не только величиной активности, но и рядом особенностей механизма взаимодействия с каналом-мишенью и внешними условиями, такими как ионный состав, pH среды, потенциал на мембране (Hille, 2001). Соответственно и поиск клинически толерантных препаратов отнюдь не сводится к поиску наиболее активных соединений. Например, единственный используемый в клинике блокатор NMDA рецепторов мемантин наиболее активным не является. Считается, что клиническая толерантность мемантина определяется такими особенностями его механизма действия, как быстрая кинетика и частичная ловушка (Chen & Lipton, 2006).

Известно, что блокада NMDA рецепторов 9-аминоакридином (9АА) осуществляется по механизму «foot-in-the-door». Закрытие ионного канала в этом случае может происходить только после диссоциации блокатора. К настоящему моменту остается до конца не выясненным вопрос о структурных детерминантах, определяющих такой характер взаимодействия 9АА с воротным механизмом NMDA рецепторов. Недавно было показано, что 9AA и его трициклические производные способны блокировать не только NMDA, но и AMPA рецепторы (Ким и др., 2007). При этом не наблюдались структурно-функциональные отношения, характерные для классических блокаторов AMPA рецепторов (Bolshakov et al., 2005). В работе было проведено подробное исследование механизмов действия 9АА и ряда его трициклических производных на AMPA и NMDA рецепторы.

Такое исследование представляется важным сразу с нескольких сторон. Во-первых, блокаторы являются ценным инструментом для исследования структуры и механизмов функционирования каналов-мишеней. Так, из сопоставления структурно-функциональных отношений в рядах блокаторов можно получить детальные сведения о строении участков их связывания в канале. Во-вторых, применение каналоблокаторов позволяет выявить роль конкретных каналов в различных процессах. Если же действие блокатора зависит от внешних условий, то его использование дает возможность определить те физиологические или патологические процессы, при которых эти условия реализуются. И, наконец, выявление фундаментальных связей между молекулярными механизмами блокады каналов и действием блокаторов в физиологических и патологических условиях может позволить предложить соединения-прототипы, которые наиболее перспективны для дальнейшей работы по созданию нейропротекторов.

Цель исследования. Изучить механизм действия трициклических соединений на ионотропные глутаматные рецепторы NMDA и AMPA подтипов.

Конкретные задачи исследования.

  1. Разработать набор критериев, позволяющий определить характер взаимодействия блокаторов с воротным механизмом NMDA рецепторов.
  2. Выявить структурные детерминанты, определяющие принадлежность 9АА к «foot-in-the-door» блокаторам NMDA рецепторов.
  3. Исследовать зависимость блокирующего действия трициклических соединений на Ca2+-проницаемые и Ca2+-непроницаемые AMPA рецепторы от потенциала.
  4. Сравнить действие трициклических соединений на АМРА и NMDA рецепторы.

Научная новизна. В работе впервые был подробно проанализирован механизм действия ряда трициклических соединений, производных 9АА, на NMDA рецепторы. Систематический анализ влияния внесенных в структуру исходной молекулы изменений на механизм действия позволил выявить одну из ключевых детерминант, определяющих принадлежность 9АА к группе «foot-in-the-door» блокаторов. Было показано, что трициклические производные с плоской трехмерной структурой сохраняют «foot-in-the-door» механизм действия 9АА, в то время как вещества с «V-образной» структурой начинают проявлять ловушку.



Также в работе было впервые показано, что 9АА и его производные с плоской трехмерной структурой взаимодействуют с особым сайтом в AMPA рецепторах. Блокирующее действие этих соединений носило потенциал-независимый характер и развивалось в отсутствие агониста, что отличает их от классических потециал-зависимых блокаторов открытого канала - дикатионных производных адамантана и фенилциклогексила. Еще одним отличием от классических блокаторов явилось отсутствие выраженной избирательности по отношению к Ca2+-проницаемым AMPA рецепторам.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При блокаде NMDA рецепторов одной из ключевых детерминант «foot-in-the-door» механизма действия 9АА является его плоская трехмерная структура.

2. Трициклические соединения с плоской структурой связываются с особым сайтом в АМРА рецепторах.

3. Сайт расположен вне поры канала и устроен похожим образом в Са2+-проницаемых и Са2+-непроницаемых AMPA рецепторах. Для связывания антагонистов с этим сайтом открытие канала не требуется.

Теоретическая и практическая значимость. Одним из следствий «foot-in-the-door» механизма действия является то, что активность таких блокаторов усиливается при увеличении концентрации агониста. То есть такие вещества могут более эффективно блокировать синаптическую передачу в патологических условиях, чем в нормальных. К сожалению, этот потенциально интересный эффект не может быть использован, поскольку 9АА обладает анти-холинэстеразным и мутагенным действием. Другие активные блокаторы NMDA рецепторов, действующие подобно 9АА, в настоящее время не известны. Мы показали, что одной из ключевых детерминант «foot-in-the-door» механизма действия этого вещества является его плоская трехмерная структура. В дальнейшем это открытие может позволить направленно синтезировать новые «foot-in-the-door» блокаторы этих ионных каналов.

При исследовании действия 9АА и его производных на AMPA рецепторы было показано, что они связываются со специфическим сайтом. Обнаружение нового класса антагонистов, имеющих механизм действия, отличающийся от описанных ранее, имеет большое значение для физиологических исследований и может способствовать появлению клинически перспективных препаратов. Антагонисты, действие которых не зависит от потенциала на мембране имеют то преимущество для защиты нейронов от повреждающего действия глутамата, что их эффект не ослабляется в том случае, когда нейрон деполяризован.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на 11-й и 12-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008 и 2009), 11-й и 12-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – Наука XXI века» (Пущино, 2007 и 2008), Международной школе «Contemporary problems of neurobiology: molecular mechanisms of synaptic plasticity» (Казань, 2007) и Международной научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009)

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в реферируемых журналах и тезисы 6 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 130 источников. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 35 рисунками.

Методы исследования. Крыс линии Вистар (возраст 13 – 18 дней) декапитировали под уретановым наркозом. Мозг быстро извлекали и охлаждали до 2 – 4оС. Затем на вибратоме “Сampden Instruments” (Великобритания) приготавливали поперечные срезы стриатума и гиппокампа толщиной 250 мкм, которые сохраняли в растворе (мМ): NaCl – 124, KCl – 5, CaCl2 – 1.3, MgCl2 – 2, NaHCO3 – 26, NaH2PO4 – 1.24, D-глюкоза – 10. Раствор аэрировали карбогеном (95% О2, 5% СО2), рН 7.4–7.5, при 24–26оС. Нейроны, экспрессирующие определенный вид глутаматных рецепторов, изолировали из срезов методом вибродиссоциации (Vorobjev, 1991) не ранее двух часов с момента их приготовления. Для исследования NMDA-каналов и Са2+-непроницаемых AMPA-рецепторов выбирали пирамидные нейроны, выделенные из поля CA1 гиппокампа, а для исследования Са2+-проницаемых AMPA-рецепторов – гигантские интернейроны стриатума. Для идентификации нейронов использовали морфологический и фармакологический критерии.

Регистрацию трансмембранных токов осуществляли методом локальной фиксации потенциала. Микропипетку заполняли раствором (мМ): CsF – 100, CsCl – 40, NaCl – 5, CaCl2 – 0.5, EGTA – 5, HEPES – 10 (pH доводили до 7.2 с помощью CsOH). Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl – 143, KCl – 5, CaCl2 – 2.5, D-глюкоза – 18, HEPES – 10 (pH доводили до 7.4, добавляя HCl). При исследовании AMPA-рецепторов во внеклеточный раствор добавляли MgCl2 в концентрации 2 мМ. Рецепторы активировали аппликацией соответствующих агонистов глутамата: NMDA-рецепторы – NMDA (40 мкМ) в присутствии глицина (10 мкМ); AMPA-рецепторы – каинатом (100 мкМ). Для аппликации применяли систему быстрой замены растворов (Vorobjev et al., 1996). При изучении механизмов блокады AMPA рецепторов использовалась 8-канальная система быстрой замены растворов с электромагнитными клапанами и шаговым двигателем RSC-200 “BioLogic” (Франция). Время смены растворов составляет для этих систем примерно 10-15 мс. Регистрацию проводили в конфигурации “целая клетка” c помощью усилителя EPC-8 “HEKA Elektronik” (Германия). Контроль мембранного потенциала, управление системой аппликации, регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью компьютера. Использовались реактивы фирм “Sigma” (США), “Tocris” (США) и “BioVectra” (Канада). Трициклические производные 9АА были синтезированы в Институте Экспериментальной Медицины РАМН. Статистическая обработка проводилась с использованием программы Microcal(TM) Origin 6.0. Все результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение в серии как минимум четырех экспериментов.





Для определения значений ИК50 использовали уравнение:

B = 100/(1+(C/ИК50)n),

где B – процент блокады, С – концентрация блокатора, ИК50 – концентрация блокатора, вызывающая 50% угнетение ответов, n – коэффициент Хилла.

Анализ потенциал-зависимости проводился с помощью формулы Вудхол (Woodhull, 1973) для непроникающих через канал частиц:

B = 100/(1+ИК50(0)exp(VFz/R/T)/C),

где B – процент блокады, ИК50(0) – расчетное значение ИК50, которая наблюдалась бы при потенциале 0 мВ, V – потенциал фиксации, z – заряд блокатора, - доля падения потенциала в мембране, соответствующая глубине нахождения участка связывания блокатора, С – концентрация блокатора. R, T и F имеют свои стандартные значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Блокада NMDA рецепторов трициклическими соединениями.

Кинетическая схема блокады. Одной из важных особенностей механизма действия блокатора служит наличие или отсутствие эффекта ловушки. Наиболее общая схема блокады открытого канала может быть представлена следующим образом:

RD2A

kd kr

kf 2kf

2A + R A + RA R2A R*2A + B

kb 2kb

k-k+ k- k+ Схема 1

2kf kf ’

2A + RB A + RAB R2AB R*2AB

kb 2kb ’

kd kr

RDB2A

Здесь A – молекула агониста, R, R* и RD обозначают соответственно закрытое, открытое и десенситизированное состояния рецептора, B – молекула блокатора. Прямая и обратная константы скоростей связывания агониста обозначены соответственно как kf и kb; константы скоростей открытия и закрытия канала обозначены, соответственно, как и ; k+ и k- - константы скоростей ассоциации и диссоциации блокатора; kd и kr – константы скоростей десенситизации и выхода из десенситизированного состояния. Ловушкой называется ситуация, когда блокатор способен оставаться в закрытом канале, то есть возможно состояние RB. Диссоциация блокатора из ловушки, как правило, возможна только после повторной активации канала. В случае ’=0, канал не может закрыться в присутствии блокатора («foot-in-the-door»).

Следует отметить, что к настоящему моменту не существует универсального критерия, позволяющего однозначно определить механизм действия блокатора. Это связано с тем, что для веществ с разной кинетикой информативными оказываются разные протоколы. Для веществ с быстрой кинетикой действия «foot-in-the-door» механизм можно выявить по характеру переходных процессов, возникающих после окончания совместной аппликации агониста и блокатора. Для веществ с медленной кинетикой можно выявить ловушку в протоколе «последовательных аппликаций».

Для анализа структурных детерминант ловушки в NMDA рецепторах был использован ряд трициклических соединений – производных классического «foot-in-the-door» блокатора 9АА. Структурные формулы изучавшихся соединений приведены в таблице 1, а количественные характеристики блокирующего действия - в таблице 2.

Таблица 1. Химические формулы использованных в работе соединений.

1. 9AA

2. ИЭМ-2120

3. ИЭМ-2115

4. ИЭМ-2116

5. ИЭМ-2117

6. ИЭМ-2118

7. ИЭМ-1921

8. ИЭМ-1925

9. Такрин



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.