WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Особенности функционирования серотонинэргических рецепторов в аорте крысы

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

БАБИЧЕВА Александра Геннадьевна

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СЕРОТОНИНЭРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ В АОРТЕ КРЫСЫ

Специальность 03.03.01 Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Астрахань - 2010

Работа выполнена на кафедре патофизиологии Астраханской государственной медицинской академии.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Тризно Николай Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кондратенко Елена Игоревна

доктор биологических наук, профессор

Котельников Андрей Вячеславович

Ведущая организация: Волгоградский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « 24 » « декабря » 2010 года в 12-00 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, д.1

Автореферат разослан 23 ноября 2010 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Ю.В. Нестеров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Большое количество работ по изучению серотонина направлено на исследование серотонинэргических механизмов в центральной нервной системе человека и млекопитающих. Гораздо меньше сведений имеется по действию серотонина на сосудистый тонус. Артериальный тонус является результатом суммирования сократительных и расслабляющих стимулов в гладкомышечных и эндотелиальных клетках (Гомазков О.А., 2000). Известно, что гормоны и нейротрансмиттеры, оказывающие влияние на тонус сосудов, могут взаимодействовать между собой. Описаны факты межрецепторного взаимодействия на уровне внутриклеточных сигнальных систем и вторичных посредников (Ullian M.E. et al., 1996; Schiffrin E.L. et al., 1995; Murasawa S. et al., 1995). Однако накопленный в настоящее время экспериментальный материал о роли различных типов серотонинэргических рецепторов в регуляции сосудистого тонуса, о запускаемых серотонином механизмах передачи сигнала в клетку и межрецепторных взаимодействиях не всегда имеет однозначную трактовку. Поэтому проблемой современных исследований рецепторов серотонина является более точное определение свойств системы, которая делает это невероятное разнообразие возможным.

Среди моноаминов серотонин является уникальным, потому что его эффекты осуществляются через 15 особых рецепторов. Большинство серотонинэргических рецепторов относятся к суперсемейству семидоменных трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белками (G-protein-coupled receptors – GPCR). Каждый из них представляет отдельную полипептидную цепь из аминокислотных остатков (Kroeze W. et al., 2003; Kristiansen K., 2004). Известно 7 основных типов рецепторов (5НТ1-5НТ7), некоторые из которых подразделяются на подтипы (5-НТ1А, 5-НТ1В, 5-HT1D, 5-HT1E, и 5-HT1F) на основе их структурных и функциональных характеристик (Hoyer D. et al., 2002). В клетках сосудов млекопитающих обнаружены 5-НТ1А, 5-НТ1В, 5-НТ1D, 5-НТ2А, 5-НТ2В, 5-НТ4, 5НТ7-рецепторы (Ullmer M.E. et al, 1995; Nilsson T. et al., 1999; Kato S. et al., 1999; Martin G., 1994).

Несмотря на безусловную значимость серотонина в регуляции сосудистого тонуса, физиологические особенности функционирования вазоконстрикторных и вазодилататорных серотонинэргических рецепторов до конца не изучены. Актуальность этой проблемы подтверждается литературными данными о развитии гиперчувствительности сосудов к воздействию серотонина при ряде патологических состояний, таких как гипертензия, атеросклероз, кровопотеря, травматический шок, астма (Chin H.P. et al., 1990; Watts S.W., 2002; Кожевникова Л.М., Авдонин П.В., 2006; Segura P. et al., 2010). Остается неясным, какие именно рецепторы участвуют в развитии избыточной реакции сосудов на серотонин. Результаты настоящего исследования потенциально могут быть использованы при разработке лекарственных препаратов на основе агонистов и антагонистов серотонина для лечения ряда сердечно-сосудистых заболеваний.

Цель исследования - выявить особенности функционирования серотонинэргических рецепторов в аорте крысы.

Задачи исследования:

  1. Идентифицировать в аорте крысы рецепторы серотонина, опосредующие констрикцию и дилатацию, с помощью их специфических агонистов и антагонистов.
  2. Исследовать влияние деполяризации плазматической мембраны гладкомышечных клеток сосудов на функционирование серотонинэргических рецепторов.
  3. Изучить воздействие вазоактивных агентов (норадреналина и эндотели-на-1) на функциональную активность серотонинэргических рецепторов.
  4. Выявить особенности функционирования серотонинэргических рецепторов на фоне долгосрочного и краткосрочного воздействия глюкокортикоидов.
  5. Провести сравнительный анализ факторов, влияющих на функционирование серотонинэргических рецепторов в аорте крысы.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование вазоконстрикторного и вазодилататорного эффекта серотонина в аорте крысы. Полученные результаты дополнили современные представления об особенностях действия специфических агонистов и антагонистов на функциональную активность различных типов серотонинэргических рецепторов. В работе изучено влияние деполяризации плазматической мембраны гладкомышечных клеток сосудов, действия эндогенных вазоконстрикторов, а также длительное и краткосрочное применение глюкокортикоидов на реакцию аорты крысы в ответ на введение серотонина. Это позволило сделать вывод об участии отдельных рецепторов в усилении сократительной реакции сосудов на серотонин.



Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования пополнили теоретические сведения о свойствах серотонинэргических рецепторов сосудов млекопитающих и их участии в регуляции тонуса аорты с формированием различных эффектов под влиянием вазоконстрикторных агентов и глюкокортикоидов. Материалы диссертации могут быть использованы при лечении осложнений, наблюдаемых у пациентов в процессе терапии глюкокортикоидами. Лекарственные препараты на основе специфических агонистов и антагонистов серотонина потенциально могут применяться в медицинской практике для поддержания сосудистого тонуса при стероид-индуцированной гипертензии, атеросклерозе, травматическом шоке, астме, мигрени, сопровождающихся избыточной реактивностью сосудов на серотонин.

Основные положения и выводы работы могут быть использованы при чтении лекций на кафедрах медико-биологического профиля Астраханской государственной медицинской академии и Астраханского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Основными вазоконстрикторными рецепторами серотонина являются 5НТ2А, которые активируют потенциалуправляемые кальциевые каналы L-типа.
  2. Рецепторы 5НТ1А, 5НТ1В, 5НТ1D, 5НТ2В и 5НТ4 типа вызывают расслабление аорты крысы независимо от активации мускариновых рецепторов.
  3. Стимулирование сократительной серотонин-индуцированной реакции аорты на фоне деполяризации плазматической мембраны гладкомышечных клеток осуществляется через 5НТ2А-рецепторы.
  4. «Молчащие» в покое вазоконстрикторные 5НТ1А-рецепторы опосредуют потенцирующий эффект норадреналина и эндотелина-1 на сосудистую реакцию, вызванную серотонином.
  5. Усиление прессорной реакции аорты на серотонин при долгосрочном воздействии дексаметазона не зависит от числа 5НТ2А-рецепторов.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (г.Москва, 2008, доклад отмечен золотой медалью за лучшую научную работу), международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине» (Украина, г.Судак, 2008), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития» (г.Звенигород, 2008), Всероссийской конференции «Научное наследие академика Л.А.Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний», посвященной 125-летию со дня рождения академика Л.А.Орбели (г.Санкт-Петербург, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (г.Москва, 2009), региональной конференции молодых ученых Астраханской государственной медицинской академии (г.Астрахань, 2010). По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, 3 из которых - в журналах из перечня ВАК РФ.

Положения диссертации были доложены на расширенном межкафедральном заседании при Астраханской государственной медицинской академии.

Структура диссертации. Работа оформлена по традиционному плану, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, главу собственных исследований, обсуждение, выводы, библиографический список.

Общий объем диссертации – 138 страниц, работа иллюстрирована 6 таблицами и 29 рисунками. Библиографический список включает 235 источников, из них 167 – иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено две серии экспериментов на 168 самцах беспородных крыс массой 200-220г. Животные содержались на стандартной диете. Все эксперименты на животных и выведение их из опыта были проведены в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP). Методы соответствуют этическим нормам, изложенным в Женевской конференции (1971), положении «Об утверждении правил лабораторной практики» (Минздрав СССР №775 от 12.08.1977), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003.

В ходе экспериментов под наркозом крыс декапитировали, извлекали грудной отдел аорты, очищали от жировой и соединительной тканей и помещали в охлажденный физиологический раствор Кребса-Хенселейта. Сосуды нарезались на кольцевые фрагменты толщиной 1-1,5 мм, которые крепили на держателях в термостатируемых камерах с физиологическим раствором (37С), аэрированным 5% карбогеном. Измерение силы сокращения изолированных фрагментов сосудов проводили в изометрическом режиме по методу Mulvany M.J. и Halpern W. (1977). Для оценки функционального состояния сосудов на них воздействовали норадреналином (НАдр) в концентрации 10-7М, а затем добавляли карбахол (10-5 М). Расслабление сосуда более чем на 50% свидетельствовало о целостности эндотелиального слоя.





Для идентификации 5HT-рецепторов, опосредующих вазоконстрикторный и вазодилататорный эффект серотонина, в работе использованы серотонин и эндотелин-1 (Sigma), селективные агонисты и антагонисты 5НТ-рецепторов: для 5HT1А рецепторов – агонисты бушпирон (“RBI”) и (R)-(+)-8-ОН-DPAT (“Alexis”) и антагонисты NAN-190 (“RBI”) или (S)-WAY 100135 (“Tocris”); для 5HT1В – агонист CGS 12066B (“Tocris”); для 5HT1D - агонист L-694,247 (“Alexis”); для 5HT2А – антагонист кетансерин (“Alexis”); для 5HT2В – BW 723C86 (“Axxora”); для 5HT2С и 5HT1С – неселективный агонист SCH 23390 (“Tocris”); для 5HT3 – агонист 5HTQ (“RBI”) и антагонист – 3-тропанил-3,5-дихлоробензоат (MDL-72222) (“RBI”); для 5HT4 - агонист RS 67506 (“Tocris”). Для активации 5HT1, 5HT5 и 5HT7 рецепторов использовали их неселективный агонист 5-карбоксамидотриптамин (“Sigma”). В ходе экспериментов применяли блокаторы прозасин (“RBI”) для 1-адренорецепторов (1-АР) и скополамин («Sigma”) для мускариновых рецепторов. В качестве деполяризующего раствора применяли раствор Кребса-Хенселайта, содержащий 15mM KCl.

В условиях целостного организма моделировали долгосрочное воздействие глюкокортикоидов с помощью внутрибрюшинного введения крысам дексаметазона (KRKA, Россия) в дозе 3 мг/кг веса животного в течение 5 дней. Для оценки влияния глюкокортикоидов на регуляцию сосудистого тонуса исследовали силу изометрического сокращения изолированных колец аорты на серотонин, эндотелин-1, норадреналин, ангиотензин II и вазопрессин.

Выделение тотальной РНК из образцов контрольных и экспериментальных сосудов осуществляли тризольным методом. Определение концентрации РНК проводили спектрофотометрическим методом. Обратную транскрипцию и ПЦР проводили на амплификаторе MasterCycler personal (Eppendorf, США). С помощью системы гель-документирования BioRad Molecular Imager Gel Doc XR System под ультрафиолетовым излучением сравнивали интенсивность свечения ПЦР-продуктов, окрашенных бромистым этидием. ПЦР с детекцией в реальном времени проводили на приборе Abi Prizm 3700 фирмы Applied Biosystems (США). Специфические праймеры для анализа исследуемых генов были изготовлены фирмой «Синтол» (Россия).

Статистическая обработка данных проводилась в программе Statistica 6.0. При оценке данных использовали критерий Стьюдента. Различия между показателями считались достоверными при уровне значимости P < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение функциональной активности серотонинэргических рецепторов в аорте крысы

5-НТ1А рецепторы. Показано, что агонист 5НТ1А-рецепторов бушпирон в концентрации 10-8М и 10-7М не стимулировал сокращение аорты. Применение бушпирона в концентрации 10-6 М приводил к существенному увеличению силы изометрического сокращения аорты. Предварительная инкубация сосудов с антагонистом 1-АР прозасином (10-7М) предотвращала констрикцию сосудов в ответ на воздействие высоких концентраций бушпирона, что подтверждает литературные данные о сродстве агонистов 5НТ1А-рецепторов к 1-АР (Yoshio R. et al., 2001). Таким образом, усиление тонуса сосудов под воздействием агонистов 5НТ1А-рецепторов связано с неспецифической активацией 1-АР (рис.1).

Бушпирон, добавленный к аорте на фоне тонической фазы сокращения НАдр, приводил к зависимому от концентрации расслаблению сосуда. Аналогичные результаты были получены при применении другого селективного агониста 5НТ1А-рецепторов (R)-(+)-8-ОН-DPAT hydrobromide (8-ОН-DPAT). В концентрациях 10-8-10-6 М данный агонист не влиял на сократимость изолированной аорты крысы. Сокращение сосуда наблюдалось только при увеличении концентрации до 10-5М. В то же время воздействие 8-ОН-DPAT (10-6 и 10-5 М) на предсокращенный НАдр сосуд приводил к его расслаблению.

Наиболее выраженным (до 80%) расслабление аорты было при воздействии на нее агонистов 5НТ1А-рецепторов в концентрации 10-5М. Кинетика кривой расслабления изолированных сосудов после добавления агонистов 5НТ1А-рецепторов бушпирона и 8-ОН-DPAT (10-6 и 10-5 М) на фоне тонического сокращения сходна с аналогичной кривой после воздействия на аорту карбохолина (КХ).

 Подавление вазоконстрикторного действия агониста 5-НТ1А-0

Рис. 1. Подавление вазоконстрикторного действия агониста 5-НТ1А рецепторов бушпирона блокатором 1-АР прозасином.

Активируя мускариновые рецепторы эндотелия, КХ вызывает образование окиси азота и гиперполяризующего фактора (Cocks T., Angus J., 1983). Для того, чтобы исключить возможность неспецифического взаимодействия бушпирона и 8-ОН-DPAT с мускариновыми рецепторами и опосредованную через эти рецепторы релаксацию сосудов, были поставлены эксперименты с использованием неселективного блокатора мускариновых рецепторов скополамина (10-6 М, 10-5 М).

После инкубации предсокращенного НАдр сосуда со скополамином (10-5М) ответ на КХ полностью исчезает, но остается неизменной релаксирующая реакция на воздействие 8-ОН-DPAT – агониста 5НТ1А-рецепторов (рис.2).

 Расслабление аорты, предсокращенной норадреналином,-1

Рис.2. Расслабление аорты, предсокращенной норадреналином, под влиянием 8-ОН-DPAT на фоне блокады мускариновых рецепторов скополамином.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.