WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Роль холестерина мембраны в секреции нейромедиатора и экзоцитозе синаптических везикул из двигательных нервных окончаний

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Тараканова Оксана Ивановна


РОЛЬ ХОЛЕСТЕРИНА МЕМБРАНЫ В СЕКРЕЦИИ НЕЙРОМЕДИАТОРА И ЭКЗОЦИТОЗЕ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ ИЗ ДВИГАТЕЛЬНЫХ НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЙ

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань-2011

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

член-корр. РАМН, Заслуженный деятель науки РФ,

Зефиров Андрей Львович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Волков Евгений Михайлович

доктор медицинских наук, профессор

Исакова Лариса Сергеевна

Ведущая организация – ГОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится « » 20 г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 212.078.02 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Федерального агентства по образованию и науке РФ по адресу: 420008, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49, корпус Б).

Автореферат разослан «__»_______________2011 г

Ученый секретарь

диссертационного cовета

д.м.н., профессор Зефиров Т.Л.

Введение

Актуальность исследования

Секреция нейромедиатора в химическом синапсе происходит в результате экзоцитоза — слияния мембраны синаптической везикулы (СВ) с пресинаптической мембраной, в результате которого порции (кванты) медиатора секретируется в синаптическую щель [Sudhof T. C., 2004]. Затем с помощью клатрин-опосредованного эндоцитоза происходит повторный захват мембранного фрагмента слившейся везикулы внутрь нервного окончания (НО) — образование новой везикулы, которая после заполнения нейромедиатором может повторно участвовать в секреции медиатора. Процессы экзо - и эндоцитоза СВ составляют везикулярный цикл, который за счет рециклирования СВ обеспечивает сохранение высокого уровня секреции медиатора при высокочастотной активности синапса (Betz W.J., et. all, 2005 Зефиров А.Л.,2007; Levitan E.S., et all, 2010).

Исторически так сложилось, что белкам вовлеченным в процессы экзо- и эндоцитоза СВ уделялась львиная доля внимания; но в последние время, благодаря развитию новых методов исследования, стало совершенно ясно, что липиды мембран также вносят существенный вклад во взаимодействие процессов экзо - и эндоцитоза. СВ. (Rohrbough J., et all, 2005, Зефиров А.Л., и др. 2010).

Так, стало известно, о существовании на поверхности мембран, так называемых «липидных плотиков», маленьких (10-200нм), динамичных, гетерогенных доменов с высокой концентрацией холестерина и сфинголипидов, предназначенных для компартментализации клеточных процессов (Pike L.J., 2006). Показано, что холестерин модулирует многие клеточные функции, изменяет активность ряда белков, например Na/K-АТФазы, аденилатциклазы, метаботропных рецепторов, Са2+- каналов, NO-синтазы, NADH-оксидазы и т. д. (Pfrieger F. W., 2003; Taverna E., et all, 2004; Weixing H., et all, 2008). Недавно липидные плотики были обнаружены в пресинаптических мембранах двигательных нервных окончаний лягушки и мыши в областях, где протекают экзо-и эндоцитоз СВ (Петров А.М., и др. 2011).

Особый интерес вызывает холестерин, один из главных липидных компонентов клеточной мембраны, присутствие которого во многом регулирует текучесть мембраны (Cevc G., et. all, 1999). Присутствие холестерина необходимо для поддержания свойственной синапсу структуры и функционирования мозга (Herring D., et all, 2003; Pfrieger F.W., 2003; Salaun C., et all, 2004; Rohrbough J., et all, 2005). Показано, что во время развития мозга, холестерин, вырабатываемый глией, усиливает процесс синаптогенеза (Mauch D.H., et all, 2001; Pfrieger F.W., 2003; Goritz C., et all, 2005). Удаление холестерина в хромаффинных клетках разрушает кластеры синтаксина, и тем самым уменьшает секрецию катехоламинов (Chamberlain L.H., et al. 2001; Lang T., et all, 2001; Gil. C., et al. 2005; Salaun C., et al. 2005). Возможно, обогащенные холестерином «липидные плотики» выполняют функцию платформ для локализации и активации белков SNARE комплекса, участвующих в слиянии мембран. Экстракция значительного количества холестерина приводит к «рассеиванию» плотиков и белков SNARE комплекса в модельных мембранах, что нарушает процессы экзоцитоза (Gil C., et all, 2005; Taverna E., et all, 2004, 2007). Исследования на мушке Drosophila показали, что в результате мутации в гене церамидазы SLAB, приводящей к перераспределению холестерина в НО, происходит уменьшение примерно на 70 % способности СВ к слиянию (Rohrbough J., et all, 2004). Велико содержание холестерина и в мембранах СВ (Deutsch E., et all, 1981), где он взаимодействует с несколькими везикулярными белками (синаптобревин, синаптофизин) (Thiele C., et all, 2000). Существует предположение о холестерине как об пространственном организаторе рециклирования СВ (Jia J.Y., et all., 2006).



Цель и задачи исследования:

Целью данного исследования явилось изучение роли холестерина плазматической мембраны в процессах секреции медиатора и экзоцитоза СВ из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

  1. Оценить изменения содержания холестерина в мембранах нервно-мышечных препаратов лягушки и мыши, обработанных различными концентрациями метил--циклодекстрина (МЦД).
  2. Исследовать эффекты различных концентраций МЦД на параметры спонтанной секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах.
  3. Изучить влияние ферментативного окисления холестерина мембраны на параметры спонтанной секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши.
  4. Проанализировать эффекты МЦД на вызванную секрецию медиатора и электрогенез нервного окончания при редком и высокочастотном раздражении в условиях пониженной внеклеточной концентрации ионов кальция.
  5. Исследовать влияние ферментативного окисления мембранного холестерина на вызванную секрецию медиатора и электрогенез нервного окончания в ответ на одиночные раздражения в условиях пониженной внеклеточной концентрации ионов кальция.
  6. Исследовать влияние МЦД на динамику секреции медиатора при высокочастотном раздражении в условиях высокой (нормальной) внеклеточной концентрации ионов кальция.
  7. Изучить динамику экзоцитоза СВ при помощи флуоресцентного метода на фоне действия МЦД.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Удаление более 50% холестерина из плазматической мембраны при действии больших доз МЦД (10мМ), приводит к кальций - независимому увеличению спонтанной секреции медиатора.
  2. Небольшое (10-20%) удаление холестерина из плазматических мембран с помощью малых концентраций МЦД (1 мМ) приводит к угнетению вызванной секреции медиатора за счет нарушения экзоцитоза СВ, увеличению времени синаптической задержки, уменьшению выраженности облегчения при низких внеклеточных концентрациях ионов Са2+ и усилению выраженности депрессии при высоких внеклеточных концентрациях Са2+ при высокочастотном раздражении.
  3. Ферментативное окисление холестерина мембран, не влияя на спонтанную секрецию медиатора и время синаптической задержки, угнетает вызванное освобождение медиатора.
  4. Холестерин плазматической мембраны участвует в процессах экзоцитоза СВ и секреции медиатора из двигательных НО, контролируя баланс между вызванной и спонтанной секрецией медиатора.


Научная новизна

Впервые показана важность холестерина в контроле соотношения спонтанной и вызванной секреции медиатора в двигательных НО лягушки и мыши. Обнаружено, усиление спонтанной секреции при удалении большого количества холестерина из мембран. Показано, что повышение частоты спонтанной секреции при действии МЦД не зависит от вне- и внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Умеренная экстракция холестерина из плазматических мембран угнетает вызванную секрецию, увеличивает синаптическую задержку, уменьшает выраженность облегчения и депрессии секреции медиатора при высокочастотном раздражении. Резкое уменьшение пула мембранного холестерина блокирует проведение ПД по нерву, тем самым полностью подавляя вызванную секрецию.

В работе получены приоритетные данные о влиянии ферментативного окисления холестерина на секрецию нейромедиатора из НО. Оказалось, что в отличие от удаления холестерина из мембран, его окисление не имеет выраженных эффектов на частоту спонтанной секреции, но увеличивает время спада миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП), и по аналогии с МЦД угнетает вызванное освобождение медиатора.

Научно-практическая ценность

Данная работа носит фундаментальный характер. Полученные результаты являются хорошим дополнением для лучшего понимания функционирования таких витальных процессов, как спонтанная и вызванная секреции, экзоцитоз и транспорт СВ, внутриклеточная сигнализация, электрогенез в нервных волокнах. Результаты работы могут быть полезны для объяснения явлений, происходящих в нейронах центральной нервной системы и клетках, активно использующих процессы экзо – и эндоцитоза. Полученные данные позволяют считать, что холестерин плазматической мембраны выступает как организатор спонтанной и вызванной секреции в нервно-мышечном синапсе. Исследование может помочь разобраться в механизмах, лежащих в основе патологических состояний, связанных с нарушением кругооборота холестерина. Работа поддержана грантами Министерства образования и науки Российской Федерации (НШ-5250.2010.4 и МК-3840.2010.4), Российского фонда фундаментальных исследований (№ 11-04-00422-а, №09-04-97015-р).

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных, и оформление публикаций.

Апробация работы

Результаты исследований, выполненные по теме диссертации, доложены на конференциях и форумах: III международном молодежном медицинском конгрессе “Санкт-Петербургские научные чтения-2009” (Санкт-Петербург, 2009); на XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (г. Калуга, 2010); международном симпозиуме «Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Пущино, 2010); XV международной Пушинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2011); международном молодежном научном форуме «Ломоносов», (Москва, 2010, 2011); международной конференции “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 2011); VІІ международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Крым, Украина, 2011); всероссийских конференциях с международным участием "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2010, 2011); на заседании кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета (2011).





Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном медицинском университете. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация объемом 132 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 256 источника, из них 11 отечественных и 245 - иностранных. Диссертация содержит 25 рисунков.

Объект и методы исследования

Эксперименты проводились на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки (Rana ridibunda) и диафрагмальной мышцы белых мышей. После выделения нервно-мышечный препарат помещали в ванночку объемом 7 мл. Все эксперименты выполнены при постоянной наружной перфузии препарата раствором Рингера для холоднокровных следующего состава (мМоль/л): NaCl — 115.0, KCl — 2.5, CaCl2 — 1.8, NaHCO3 — 2.4. Для теплокровных животных использовали раствор Кребса (мМоль/л): NaCl —.144,0; KCl — 5,0; MgCl2 – 1,0; CaCl2 – 2,0; NaH2PO4 — 1,0; NaHCO3 —2,4; C6H12O6 — 11,0. В экспериментах с высокой концентрацией Ca2+ (1,8ммоль/ л) блокирование мышечных сокращений достигалось за счет добавления d-тубокурарина (3-5мкмоль/л). В условиях низкого Са2+ использовался модифицированные растворы Рингера и Кребса с концентрацией Са2+ (0,3-0,5 мМоль/л) и Мg (4,0мМоль/л). Все эксперименты проведены при температуре 20оС, рН поддерживался на постоянном уровне 7.2-7.4. Раздражение двигательного нерва осуществляли прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой силы с частотой 0,5 – 50 имп/с.

В экспериментах применяли следующие фармакологические препараты: МЦД (метил--циклодекстрин)- водорастворимый олигосахарид, образующий полость, в которую захватывается холестерин из мембран (Yancey P.G., et al., 1996), в концентрации 0,1; 1; 5; 10 мМ; холестеролоксидаза (ХО) ( из бактерий рода Streptomyces sp,1 активная единица) - окисляющая холестерин до образования холест -4- ен-3- она; ионы Cd2+ 1мМ; BAPTA-AM (1,2-bis(2-Aminophenoxy)ethane – N,N,N’,N’-tetraacetic acid acetoxymethyl ester) – «быстрый» мембранопроникающий кальциевый буфер; филипин – флуоресцентный атнибиотик, специфически связывающийся с холестерином; для фиксации препаратов - формалин (3%). Все использованные вещества фирмы «SIGMA» (США).

Регистрация синаптических сигналов. Метод внеклеточного отведения использовался в экспериментах с пониженной внеклеточной концентрацией ионов Са2+ и увеличенной концентрацией ионов Мg2+ (Зефиров А.Л. и др., 1990). Для внеклеточной регистрации использовали стеклянные микроэлектроды, заполненные раствором NaCl (2ммоль/л), с диаметром кончика около 1-2 мкм и сопротивлением 1-5 МОм. Электрод прижимали к поверхностно лежащему НО и регистрировали спонтанные, миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП) и вызванные раздражением двигательного нерва ответы нервного окончания и токи концевой пластинки (ТКП). Частоту МТКП определяли по среднему интервалу времени между соседними МТКП (в с-1). Квантовый состав ТКП рассчитывали используя метод выпадений, по формуле m = ln(N/N0), где N - общее количество раздражений, а N0 - количество раздражений, не вызвавших появления ТКП. Синаптическую задержку определяли как интервал времени между пиком пресинаптического ПД и началом одноквантового ТКП. Для анализа использовали 250-600 ТКП или МТКП.

Метод внутриклеточной регистрации использовали при высоких внеклеточных концентрации ионов Са2+. Использовали стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 2-10 МОм, заполненные 3М раствором KCl. Введение микроэлектрода в мышечное волокно осуществляли в области НО под визуальным контролем. Этот вид отведения использовался для анализа вызванных, многоквантовых потенциалов концевой пластинки (ПКП) возникающих в ответ на длительное высокочастотное раздражение двигательного нерва. После регистрации ПКП рассчитывали квантовый состав (m) каждого ПКП при определение квантового размера (q) через дисперсию амплитуды ПКП. (Elmqvist D. et al., 1965; Hubbard J.I., et al., 1973; Зефиров А.Л., и др., 2008). В основе метода лежат предположения о неизменности количества медиатора в везикуле, неизменности чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору в процессе ритмического раздражения и пропорциональности амплитуды ПКП количеству освободившихся квантов. В массиве значений амплитуд ПКП, полученном при длительном ритмическом раздражении, выбирали участок, в котором рассчитывали квантовую величину по формуле:,

где 2 –дисперсия амплитуды ПКП на выбранном участке, <V>-средняя амплитуда ПКП.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.